Gram Pozitif Bakteri Bacillus megaterium'dan Protoplast Üretimi

Özet

Kaynak: Figueroa, D.M., ve diğerleri. Antimikrobiyal peptit lokalizasyonunu karakterize etmek için bakteriyel sferoplastların ve protoplastların üretimi ve görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, Gram pozitif bakteri Bacillus megaterium'dan protoplast üretmek için adım adım bir prosedürü göstermektedir.

Protokol

1. Çözelti Hazırlama

1. 50 mL'lik bir şişede 0.015 g lizozimi 3 mL dH₂O içinde çözerek 5 mg/mL lizozim hazırlayın. 0,2 μm membranlı 25 mm'lik bir şırınga filtresinden süzerek sterilize edin. Alikot çözeltisini mikrofüj tüplerine koyun ve -20 °C'de saklayın.
2. 30 g TSB'yi 1 L dH₂O içinde 2 L'lik bir şişede çözerek %3 w/v Triptikaz Soya Suyu (TSB) hazırlayın. Çözeltiyi, B. megaterium protoplastlarının hazırlanmasında kullanılmak üzere 100 mL TSB içeren şişelere ayırın. Sıvı ortamı sterilize etmek için otoklav şişeleri. Steril TSB, oda sıcaklığında veya 4 °C'de saklanabilir.
3. 34.23 g sükroz (342.3 g/mol), 0.46 g maleik asit (116.07 g/mol) ve 0.38 g MgCl_{2 (}95.21 g/mol) 250 mL'lik bir şişede 100 mL dH2 O içinde. pH'ı 6,5'e ayarlayın. 0,2 μm membranlı 25 mm'lik bir şırınga filtresinden süzerek sterilize edin ve oda sıcaklığında konik bir tüpte saklayın.
4. 1 L'lik bir cam şişede 100 mL% 3 w/v TSB ve 100 mL C çözeltisini karıştırarak 200 mL protoplast ortamı hazırlayın. Çözeltiyi sterilize etmek ve oda sıcaklığında saklamak için otoklavlayın.

2. Gram pozitif B. megaterium Protoplastların Hazırlanması

1. 250 mL'lik bir şişede, gece kültürünü 100 mL% 3 w / v TSB içinde 1:1.000 seyreltin ve bakteri çözeltisini 37 ° C'de inkübe ederken, çözelti 600 nm'de 0.9-1.0 optik yoğunluğa ulaşana kadar yaklaşık 4.5 saat çalkalayın. Bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluğu ölçün.
2. Sıvı kültürü iki adet 50 mL'lik konik tüpe dökün ve 2.000 x g, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
3. Serolojik bir pipet kullanarak, süpernatanı her iki konik tüpten atın. Her peleti 2,5 mL protoplast ortamında yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse edilen çözeltileri tek bir konik tüpte birleştirin. Kombine yeniden süspanse edilmiş çözeltiyi 125 mL'lik bir şişeye pipetleyin.
4. 1 mL 5 mg/mL lizozim ekleyin ve çalkalayarak 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
5. Bir ışık mikroskobu kullanarak 1.000x büyütme altında protoplastların büyümesini izleyin ve küreler yerine şişmiş çubuklar olarak görünen bakteriler gibi düzensizlikleri not edin (Şekil 1). Serolojik bir pipet kullanarak çözeltiyi 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 2.000 x g, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
6. Süpernatanı boşaltın ve peleti 5 mL protoplast ortamında yeniden süspanse edin. Protoplastları -20 °C'de bir haftaya kadar veya 3 donma-çözülme döngüsünden geçene kadar saklayın.

Sonuçlar

Şekil 1: B. megaterium'un temsili görüntüleri. (A) B. megaterium bakterileri ve (B) B. megaterium protoplast. Görüntüler 100X büyütmede çekildi

Malzemeler