Bağırsak Epitel Tek Tabakalarında E. coli'nin Transsitozunun Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Islam, A., et al., Neonatal Escherichia coli Bakteriyemi İzolatlarının Bağırsak Transsitozunun Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2023)

Bu video, transwell ekleri, elektrik direnci ölçümü ve bakteri ölçümü kullanılarak bağırsak epitel tek tabakaları boyunca yenidoğan Escherichia coli'nin transsitozunu değerlendirme prosedürünü göstermektedir.

Protokol

1. Hücrelerin aşılanması (deneyin başlangıcı)

1. Tam olarak 2 saat sonra, sabah bakteri kültürlerini çalkalayıcıdan çıkarın ve 10 dakika (1.900 x g, 4 °C) santrifüjleyin.
   NOT: Aşağıdaki tüm adımlar için, büyümeyi en aza indirmek için tüm bakteri süspansiyonlarını buz üzerinde tutun.
2. Bakteri peletini doku kültürü ortamında (TCM) antibiyotikler olmadan yeniden süspanse edin. Optik yoğunluğu (OD) 0.7-0.9'a ayarlamak için bir spektrofotometre kullanın ve ayrıca 1 x 10⁶ koloni oluşturan birim (CFU)/mL (yaklaşık 1:100 seyreltme) konsantrasyonuna kadar antibiyotiksiz TCM ile seyreltin. Her bir eki 100 μL hacim başına 1 x^{10 5} CFU ile enfekte etmek için bu bakteri süspansiyonunu kullanın.
3. Transwell plakasını etiketleyin ve her bir kesici ucu 100 μL OD ayarlı inokulum ile enfekte edin (ek parça başına toplam 1 x 10⁵ CFU). Test şimdi başladı. Saati not edin ve t = 0 h olarak kaydedin.
4. İz seyreltme yöntemini kullanarak CFU/mL'yi ölçmek için aşı bakteri süspansiyonunu plakalayın, kare LB agar plakaları üzerine 10 μL alikotlar kaplayın.

2. Transsitozun ölçülmesi

1. Aşılamayı takiben her 30 dakikada bir, yeni kuyucukları antibiyotiksiz 500 μL TCM ile doldurun. Her farklı bakteri suşu için farklı bir steril forseps seti kullanarak ekleri bu yeni kuyucuklara aktarın.
2. Her bir ek parça için kullanılmış toplama kuyusundan medyayı ayrı etiketli tüplere toplayın. Bu tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Zaman noktaları arasında, transwell plakalarını inkübatöre geri koyun.
3. Her ek için, t = 0,5 saat, t = 1 saat, t = 1,5 saat ve t = 2 saat arasında toplanan medyayı birleştirin ve kısaca girdap yapın. Deneyin ilk 2 saatinde transsitoza uğrayan bakteri miktarını ölçmek için iz seyreltme yöntemini kullanarak toplanan ortamı Luria-Bertani (LB) agar plakalarına yerleştirin.
   NOT: Bakterilerin her 30 dakikada bir alınması ve buz üzerinde tutulması, toplama kuyularında bakteri üremesini en aza indirir ve ölçümler ağırlıklı olarak transsitoz bakterileri üzerinde yapılır.
4. Etiketli iz seyreltme LB agar plakalarını ek CO₂ olmadan 37 °C'de bakteri inkübatörüne yerleştirin ve T84 transwell plakasını doku kültürü inkübatörüne geri koyun.
5. t = 4 saatte, t = 2,5 saat, t = 3 saat, t = 3,5 saat ve t = 4 saatten toplanan medyayı birleştirerek 2.3 adımını tekrarlayın.
6. t = 6 saatte, t = 4,5 saat, t = 5 saat, t = 5,5 saat ve t = 6 saatten toplanan medyayı birleştirerek 2.3 adımını tekrarlayın. Ek olarak, t = 6 saatte, ortamı kontrol kuyularından kaplayın.

3. Deneyin sonu

1. Deneyin sonunda transepitelyal elektrik direncini (TEER) ölçün ve kaydedin, t = 6 saat.
2. Probu 10-15 dakika boyunca %70 etanole batırarak dekontamine edin. İstenirse, ekleri atın veya ek uygulamalar için kaydedin/işleyin. LB agar plakalarının gece boyunca inkübe olmasına izin verin ve kullanılan diğer tüm malzemeleri dezenfekte edin ve/veya güvenli bir şekilde atın.
3. Gece boyunca inkübasyondan sonra, aşı miktarını ve E. coli transsitoz miktarını belirlemek için iz seyreltme LB plakalarındaki bakteri kolonilerini manuel olarak sayın. Kontrol plakalarının herhangi bir bakteri üremesi göstermediğinden emin olun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 mL steril konik tüpler	Orta Bilim	C15B
2 mL mikrosantrifüj tüpleri	Avant	AVSS2000
50 mL steril polipropilen konik tüpler	Doğan	352070
Merkezkaç	Sorvall	Efsane RT
Tek kullanımlık aşılama döngüleri	Balıkçı markası	22363605
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)	Gibco	11965-084
Epitelyal Volt/Ohm Metre	Dünya Hassas Aletler	EVOM
Kuluçka makinesi çalkalayıcı	Yeni Brunswick	Innova 4080 Serisi
Inkübatörler	Termo Bilimsel	51030284	Yöntemde bunlardan üçü kullanılır: biri steril doku kültürü için, biri enfekte doku kültürü için ve biri bakteri inkübasyonu için.
Lizojeni suyu	Difco	244610
Lizojeni suyu agar	IBI Bilimsel	IB49101
Spektrofotometre	Unico	1100RS
T84 Bağırsak Hücreleri	Amerikan Doku Kültürü Koleksiyonu	CCL248 Serisi
Polietilen treftalat membranlı, 3 μm gözenekli, 24 kuyucuklu doku kültürü ekleri	Doğan	353096
Doku kültürü plakası, 24 kuyucuk	Doğan	353504