Bu video, bir antibiyotik direnç geni taşıyan uyuyan bakteriyofaj DNA'sı ile tasarlanmış genetiği değiştirilmiş bir Borrelia burgdorferi kültürünün hazırlanmasını göstermektedir. Antibiyotik seçimi ve inkübasyonunu takiben, kimyasal bir indükleyici DNA hasarını tetikleyerek direnç genini içeren yeni viryonların eksizyonuna, replikasyonuna ve montajına yol açar. İkinci bir santrifüjleme ve yeniden süspansiyondan sonra, olgun viral partikülleri barındıran bakteri hücreleri, sonraki uygulamalar için hazırdır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Viral Partikül Üretimi için Borrelia burgdorferi Kültürlerinin Hazırlanması ve İndüksiyonu
769 görüntülenme
⸱
26 Eylül 2025
Bu makalede
Özet
Protokol
1. φBB-1 üretimi için B. burgdorferi kültürünün hazırlanması
- %6.6 ısıyla inaktive edilmiş normal tavşan serumu (BSK) ile desteklenmiş Barbour-Stoenner-Kelly ortamını hazırlayın. 1 L 1x BSK için, Tablo 1'de listelenen bileşenleri 900 mL suda birleştirin, 1 N sodyum hidroksit kullanarak pH'ı 7,6'ya ayarlayın ve 2-4 saat boyunca 4 °C'de yavaşça karıştırın. Karıştırma işlemi tamamlandıktan sonra pH'ı kontrol edip gerekirse 7,6'ya ayarlayın ve su ile hacmi 1 L'ye yükseltin. Ortamı 0,22 μM'lik bir filtreden geçirerek sterilize edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve taze olarak kullanın veya 4 °C'de ≤2 ay saklayın.
- Transdüksiyon protokolüne başlamadan üç ila beş gün önce, 150 μL uygun B. burgdorferi klon(lar)ını sıkıca kapatılmış steril konik santrifüj tüplerinde 15 mL 1x BSK'ya aşılayın (bkz. B. burgdorferi klon(lar)ı içindeki heterolog DNA'nın seçimi ve bakımı için ortamı uygun konsantrasyonda antibiyotik veya bir antibiyotik kombinasyonu ile destekleyin (Tablo 2).
NOT: B. burgdorferi biyogüvenlik seviyesi 2 organizmadır. Bu organizma ile çalışırken tüm uygun önlemleri alın. Tüm çalışmaları, sertifikalı ve uygun şekilde dezenfekte edilmiş bir sınıf II biyogüvenlik kabininde B. burgdorferi'nin canlı kültürleriyle gerçekleştirin. B. burgdorferi ve organizmaların kendileriyle temas eden tüm materyalleri Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) yönergelerine göre uygun şekilde atın. - Kültürleri 33 °C'de, kültürler yaklaşık 3-5 gün süren ≥5 ×10 7 spiroket·mL-1 yoğunluğa ulaşana kadar çalkalamadan inkübe edin.
3. B. burgdorferi fajı φBB-1'in indüksiyonu
NOT: Tüm cam eşyaları ve plastik eşyaları otoklavlayarak sterilize edin; tüm çözeltileri otoklavlayarak veya 0,22 μM'lik bir filtreden geçirerek sterilize edin. Aşağıdaki adımlar 15 mL'lik hacimlere göre sunulmuştur, ancak yöntem, deneyin bireysel ihtiyaçlarına bağlı olarak daha küçük veya daha büyük hacimlere ölçeklenebilir.
- Fajın üretileceği B. burgdorferi kültürü (donör) için, 4 mL 2 × 108 spiroket·mL-1 elde etmek için gereken başlangıç kültürü hacmini belirlemek için adım 2'de her iki yöntemle hesaplanan konsantrasyonu kullanın. Bu, geri kazanım aşamasında 15 mL'de 5 ×10 7 spiroket·mL-1'lik bir nihai konsantrasyon verecektir (aşağıdaki adım 3.6).
- Adım 3.1'de hesaplanan kültür hacmini 10 dakika boyunca 6.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve peleti 4 mL taze BSK içinde yeniden süspanse edin. Numuneyi minimum üst boşlukla tutmak için numuneyi mevcut en küçük steril tüpe aktarın.
- Faj üretimini indüklemek için 4 mL'lik bir kültür hacmine dayalı olarak önerilen konsantrasyona (Tablo 3) uygun miktarda indükleyici ajan ekleyin. Tüpü sıkıca kapatın ve iyice karıştırın.
- Numuneyi 33 °C'de 2-4 saat inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra numuneyi 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Numuneyi 10 dakika boyunca 6.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın.
- Hücre peletini 15 mL 1x BSK'da yeniden süspanse edin.
Tablo 1: Transdüksiyon deneyleri için B. burgdorferi klonlarının yetiştirilmesi ve seçimi için BSK. B. burgdorferi'nin kültürlenmesi için 1x BSK'nın ve katı faz seçimi için 1.5x BSK'nın formülasyonu ve hazırlanması B. burgdorferi burada açıklanan klonlar Samuels'e dayanmaktadır. B. burgdorferi'nin büyümesini destekleyen farklı BSK (veya MKP) formülasyonları, transdüksiyon testi kullanılarak henüz test edilmemiştir.
| Parça | 1x BSK (kültür için) (1 L) | 1,5x BSK (kaplama için) (1 L) |
| Sığır serum albümini (fraksiyon V) | 35 gr | 52,5 gr |
| 10x CMRL-1066 (L-glutamin olmadan) | 8 gr | 12 gr |
| Neopepton | 4 gr | 6 gr |
| evet | 1,6 gr | 2,4 gr |
| HEPES | 4,8 gr | 7,2 gr |
| Glikoz | 4 gr | 6 gr |
| Sodyum sitrat | 0,56 gr | 0,84 gr |
| Sodyum piruvat | 0,64 gr | 0,96 gr |
| N-asetil-glukozamin | 0,32 gr | 0,48 gr |
| Sodyum bikarbonat | 1,76 gr | 2,64 gr |
| Isı ile inaktive edilmiş normal tavşan serumu (INRS) | 66 milyon L | 99 mL |
Tablo 2: Heterolog DNA'nın seçimi ve bakımı için kullanılacak potansiyel antibiyotikler ve konsantrasyonlar B. burgdorferi. Bu liste, Borrelia burgdorferi'de yaygın olarak kullanılan mevcut antibiyotiğe dirençli belirteçlere dayanmaktadır. Kanamisin, gentamisin ve streptomisin suda hazırlanır, 0,22 μM'lik bir filtreden filtreyle sterilize edilir ve -20 °C'de saklanır. Eritromisin %95 etanol içinde hazırlanır ve -20 °C'de saklanır. Birçok laboratuvar, 200 μg·mL-1 konsantrasyonunda seçim için kanamisinin başarılı bir şekilde kullanıldığını bildirmektedir; transdüksiyon deneylerinde seçim için hem gentamisin hem de kanamisin kullanıldığında, 400 μg·mL−1 kanamisin kullanılır. aadA geni hem streptomisin hem de spektinomisin'e direnç kazandırır. E'de aadA genini içeren yapıların seçimi için.coli, 100 μg·mL−1 spektinomisin kullanılır. Aminoglikozitlerin (kanamisin, gentamisin ve streptomisin) Lyme hastalığının tedavisinde klinik olarak anlamlı olmadığını unutmayın; Bununla birlikte, eritromisin belirli durumlarda klinik olarak kullanılır. B. burgdorferi'de bu antibiyotiğe karşı doğal direnç bildirilmiş olmasına rağmen, bu direnç belirteci şu ana kadar burada bildirilen transdüksiyon deneylerinde kullanılmamıştır.
| Antibiyotik | Stok konsantrasyonu | Bb kültüründe son konsantrasyon |
| Kanamisin | 100 mg.mL-1 (suda) | 200-400 μ g.mL-1 |
| Gentamisin | 50 mg.mL-1 (suda) | 50 μ g.mL-1 |
| Streptomisin | 50 mg.mL-1 (suda) | 50 μ g.mL-1 |
| Eritromisin | 2 mg.mL-1 (EtOH'de) | 0,06 μ g.mL-1 |
Tablo 3: B. burgdorferi'den φBB-1'in indüklenmesi için kullanılan potansiyel indükleyici ajanlar ve konsantrasyonlar. N-metil-N′-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), mitomisin C ve etanolün yanı sıra metanol ve izopropanolün, B. burgdorferi suşu CA.11-2A'da φBB-1'i yapısal seviyelerin üzerinde indüklediği gösterilmiştir. MNNG şüpheli bir kanserojen ve çevresel tehlikedir; dikkatli kullanın, yanıcı bir çözücü içinde çözün ve imha etmek için yakın. Mitomisin C, şüpheli bir kanserojen ve potansiyel çevresel tehlikedir; Kimyasal çeker ocak altında dikkatli kullanın ve uygun şekilde atın. Yayınlanan veriler, MNNG'nin φBB-1'i indüklemek için en etkili ajan olduğunu öne sürse de, bu kimyasalla çalışmanın tehlikeleri ve onu elde etmedeki zorluklar, özellikle öğrenciler arasında kullanımını karmaşık hale getirmektedir. Etanol ile indüksiyon, metanol veya izopropanol ile sürekli olarak daha iyidir ve en yaygın olarak transdüksiyon tahlilinde kullanılmıştır.
| İndükleyici ajan | Stok konsantrasyonu (çözücü) | Numunedeki nihai konsantrasyon |
| Etanol | %100 (yok) | 5% |
| Mitomisin C | 2 mg.mL-1 (su) | 20 μ g.mL-1 |
| 1-metil-3-nitroso-nitroguanidin (MNNG) | 50 mg.mL-1 (DMSO) | 10 μ g.mL-1 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 L filtre üniteleri (PES, 0,22 μm gözenek boyutu) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| 12 mm x 75 mm boru (çift konumlu kapak) (polipropilen) | ABD Bilimsel | 1450-0810 | düşük boşluk hacmiyle 4 mL tutar (indüksiyon için) |
| 15 mL konik santrifüj tüpleri (polipropilen) | ABD Bilimsel | 5618-8271 | |
| 1-metil-3-nitroso-nitroguanidin (MNNG) | Millipore Sigma | DİKKAT: potansiyel kanserojen; artık hazır değil, teklif edilen ikameyi test etmedim | |
| 5.75" Pasteur Pipetleri (pamuk tıkaçlı/borosilikat cam/steril olmayan) | Thermo Fisher Bilimsel | 13-678-8A | Kullanmadan önce otoklavlayın |
| 50 mL konik santrifüj tüpleri (polipropilen) | ABD Bilimsel | 1500-1211 | |
| Mutlak etanol | |||
| Bakto Neopepton | Gibco | DF0119-17-9 Serisi | |
| Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
| Sığır serum albümini (serum replasman derecesi) | Gemini Biyo-Ürünleri | 700-104P | |
| CMRL-1066 L-Glutaminsiz (toz) | ABD Biyolojik | C5900-01 Serisi | Hücre kültürü sınıfı |
| Eritromisin | Araştırma Ürünleri Uluslararası A.Ş. | E57000-25.0 | |
| Gentamisin reaktif çözeltisi | Gibco | 15750-060 | |
| Glikoz (Dekstroz Susuz) | Thermo Fisher Bilimsel | BP350-500 Serisi | |
| HEPES | Thermo Fisher Bilimsel | BP310-500 Serisi | |
| Kanamisin sülfat | Thermo Fisher Bilimsel | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (0,22 μM gözenek boyutu) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | Sterilize Antibiyotikleri ve Diğer Küçük Hacimli Çözeltileri Filtrelemek İçin |
| Mitomisin C | Thermo Fisher Bilimsel | BP25312 | DİKKAT: potansiyel kanserojen; Sadece kimyasal çeker ocakta kullanın |
| N-asetil-D-glukozamin | MP Biyomedikal, LLC | 100068 | |
| Petri Kabı (100 mm × 15 mm) | Thermo Fisher Bilimsel | FB0875712 | |
| Tavşan serumu steril olmayan eser hemolize genç (NRS) | Pel-Freez Biyolojik Ürünler | 31119-3 | üreticinin talimatlarına göre ısı devre dışı bırakma |
| Sodyum bikarbonat | Thermo Fisher Bilimsel | BP328-500 | |
| Sodyum piruvat | Millipore Sigma | P8674-25G | |
| Streptomisin sülfat çözeltisi | Millipore Sigma | S6501-50G | |
| Trisodyum sitrat dihidrat | Millipore Sigma | S1804-500G | BSK için sodyum sitrat |
