Bakteriyel Biyosensör Kullanarak Hedef Analitin Tespiti

Özet

Kaynak: Barber, A. E., ve diğerleri. Ateşli silah kalıntısının varsayımsal tespiti için yeni bir bakteriyel biyosensörün hazırlanması ve uygulanması. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, bakteriyel bir biyosensör kullanılarak spesifik analitlerin tespitini göstermektedir. Analite duyarlı bir promotör altında kırmızı floresan protein (RFP) genine sahip bir plazmit taşıyan bir bakteri kültürü alınır. Test yüzeyi iyice silindikten sonra, mendilin küçük bir bölümü kültüre daldırılır ve inkübe edilir. Promotör ile analit etkileşimi, hedef analitin varlığını doğrulayarak RFP ekspresyonunu aktive eder.

Protokol

NOT: Kırmızı floresan proteini (RFP) eksprese eden E. coli'nin sentezi sunulmaktadır.

1. E. coli'den plazmit deoksiribonükleik asidin (DNA) hazırlanması

1. Bir RFP geni ve bir ampisilin direnç geni içeren bir plazmit içeren E.coli'yi çözün ve E.coli'yi 24 saat boyunca 37 ° C'de 100 μg / mL ampisilin içeren Luria Broth (LB) agar plakalarında büyütün. Örneğin, sentetik biyoloji için kullanılan standart biyolojik parçaların kayıt defterinden J10060 plazmitini kullanın (bkz. J10060 plazmidi, bir pBad promotör bölgesinin kontrolü altında RFP için bir gen ve bir ampisilin direnç geni içerir. Alternatif olarak, E.coli'yi (adım 3.2'ye bakın) LB agar plakalarında büyümeden önce plazmit ile dönüştürün.
2. J10060 plazmitini içeren bir E. coli kültürünün 1 mL'sinden DNA'yı izole etmek için standart bir miniprep protokolünü izleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Aşağıdaki protokolün amacı, pBad promotörünü çıkarmak ve cihaz için istenen promotör ile değiştirmektir.
3. Plazmit mini hazırlığını takiben, DNA'yı sindirime hazır olana kadar dondurucuda saklayın.

2. Kısıtlama enzimi sindirimi

1. EcoRI ve NheI sindirimi için bir mikrosantrifüj tüpünde aşağıdaki reaksiyonu kurun: 10 μL J10060 plazmit DNA (adım 1'de izole edilmiştir), 8 μL su ve 1 μL tampon ile önceden karıştırılmış EcoRI ve NheI enzimlerinin her biri 1 μL (bkz.
2. Promotör DNA için, EcoRI ve NheI sindirimi için bir mikrosantrifüj tüpünde aşağıdaki reaksiyonu kurun: 10 μL tavlanmış promotör DNA dizileri (8 μL su ve 1 μL EcoRI ve NheI enzimlerinin her biri 1 μL tampon ile önceden karıştırılmıştır.
   1. Antimon (Sb-), Kurşun (Pb-) veya Trinitrotoluen (TNT)-RFP için ( Malzeme Tablosuna bakınız), oligonükleotitleri tampon (30 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), pH 7.5; 100 mM potasyum asetat) içinde çözün, eşit molar konsantrasyonlarda inkübe edin, 2 dakika boyunca 94 °C'ye ısıtın ve oda sıcaklığında kademeli olarak soğutun).
3. Numuneleri, 10 μL'ye ayarlanmış pipetle hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
4. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
5. Enzimleri 80 °C'de 5 dakika boyunca ısıyla inaktive edin.
6. Sindirilmiş DNA'yı bir sonraki adıma hazır olana kadar dondurucuda saklayın.

3. Ligasyon ve dönüşüm

1. Ligasyon
   1. Adım 2'de EcoRI ve NheI ile çift sindirilen plazmit ve promotör DNA'sını kullanarak, Tablo 1'de gösterilen reaksiyon karışımını buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde kurun; en son T4 DNA Ligazını ekleyin. NOT: Tablo 1 , belirtilen DNA boyutları için eklemek için 1:3 vektör molar oranı kullanan bir ligasyonu göstermektedir.
   2. Reaksiyonu yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın ve kısa bir süre mikrosantrifüj yapın.
   3. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
   4. 65 °C'de 10 dakika ısıyla inaktive edin.
2. Dönüşüm
   1. 20 μL DH5-alfa Yetkin E. coli hücreleri içeren bir tüpü, son buz kristalleri kaybolana kadar buz üzerinde çözün.
   2. Hücre karışımına 5 μL plazmit DNA ekleyin. Hücreleri ve DNA'yı karıştırmak için tüpü 4-5 kez dikkatlice hafifçe vurun.
   3. Karışımı 2 dakika buz üzerine koyun.
   4. Tam 42 °C'de tam 30 saniye boyunca ısı şoku. Karıştırmayın.
   5. 2 dakika buz üzerine koyun. Karıştırmayın.
   6. Karışıma 380 μL oda sıcaklığında katabolit baskılamalı (SOC) süper optimal et suyu pipetleyin. Hemen ampisilin (100 μg/mL) içeren bir LB agar plakasına yayın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
   7. Plakaları büyüme açısından 24 saat içinde kontrol edin.
   8. Plakaları sızdırmazlık filmiyle kapatın ve bir sonraki adıma hazır olana kadar buzdolabında saklayın.

4. Koloni polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)

1. Tablo 2'de gösterilen reaksiyon karışımlarını bir PCR tüpüne ekleyin (4 reaksiyon tüpü kurun).
2. Yukarı ve aşağı pipetleyerek reaksiyonları yavaşça karıştırın.
3. Sarı bir pipet ucu kullanarak, dönüştürülmüş E. coli'nin bir kolonisini (veya çok küçük bir bölgesini) kazıyın. Bu E. coli'nin bir parçasını kesitlenmiş yeni bir LB/ampisilin/agar plakasına aktarın ve ardından pipet ucunu PCR tüpüne yerleştirin. E. coli'yi PCR karışımıyla karıştırmak için pipet ucunu sallayın. Ek koloniler için üç kez daha tekrarlayın. PCR tüplerini bir PCR makinesine aktarın ve Tablo 3'te gösterilen programı kullanarak termocycle'a başlayın.
4. Hangi kolonilerin plazmide en iyi ligasyona sahip olduğunu belirlemek için TAE 9Tris-Asetat-EDTA'da %2'lik bir agaroz jel kullanarak jel elektroforezi çalıştırın ve bu kolonileri yeni bir plaka üzerinde büyütün.
5. Plakaları teste hazır olana kadar buzdolabında saklayın. Kimyasal test için Luria suyunda 100 μg/mL ampisilin eklenmiş sıvı bir kültür hazırlayın.

5. DNA Dizilimi

1. Her numune için 5 μL plazmit, 4 μL dizileme primeri ve 3 μL deiyonize su ekleyin.
2. Bu karışımı bir tüpe koyun ve DNA dizilimi için gönderin (bkz.
3. Mutasyon olmadığından ve genlerin doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olmak için DNA dizi analiz yazılımını kullanarak beklenen ve gözlemlenen DNA dizilerini karşılaştırmak için DNA dizisi verilerini analiz edin.
   NOT: E. coli'nin kimyasal sensör olarak kullanılması aşağıda sunulmuştur.

6. E. coli kültürlerinin hazırlanması

1. Sıvı kültürler için LB'yi 100 μg/mL ampisilin ile hazırlayın.
2. Sensör bakterilerinin, pozitif kontrol* bakterilerinin ve negatif kontrol** bakterilerinin sıvı kültürlerini hazırlayın.
   NOT: *Pozitif kontrol bakterileri: Kurucu bir promotörün kontrolü altında RFP genine sahip bir plazmit içeren E. coli; Bu çalışmada sentetik biyoloji için kullanılan standart biyolojik parçaların kayıt defterinden E1010 plazmidi kullanılmıştır (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılmıştır.**Negatif kontrol bakterileri: E. coli pBad promotörü (sentetik biyoloji için kullanılan standart biyolojik parçaların kaydından plazmit J10060 (bkz.
3. Kültürleri 37 ° C'de ve 220 rpm'de en az 8 saat, en fazla 18 saat çalkalayan bir inkübatöre yerleştirin. Bulanık et suyu bakteri üremesini gösterir.

7. Cihazın işlevini kontrol etmek için E. coli'nin titre edilmesi

NOT: Sensörler işlevi kontrol etmek için titre edildikten sonra bu adımın tekrarlanmasına gerek yoktur. Kurşun, antimon ve 2,4-DNT veya 1,3-dinitrobenzen (1,3-DNB) ilavesi şeklindeki pozitif bir kontrol, tam titrasyona gerek kalmadan her kullanım için cihazların işlevini kontrol edebilir.

1. Suda 10 ppm konsantrasyonda ilgilenilen analit(ler)in stok çözeltisini hazırlayın. Çözünürlük bir sorunsa, 50/50 su/metanol karışımı kullanın.
2. Tablo 4'ü kılavuz olarak kullanarak, uygun sayıda steril kültür tüpünü etiketleyin ve her tüpe 2 mL kültürlü et suyu (protokol adımı 6'dan) yerleştirin.
   NOT: Genel bir analitik aralık belirlemek için, sensör bakterileri ile en az üç farklı analit seviyesi, negatif kontrol ile bir seviye ve pozitif kontrol ile bir seviye yapın. Ayrıca, ilave metal içermeyen bakterilerin her birinden bir tüp olmalıdır (başka bir negatif kontrol türü). Analitik aralığı ve tespit sınırlarını daha doğru bir şekilde belirlemek için daha geniş bir analit konsantrasyonu aralığı kullanın.
3. Tablo 4'te belirtildiği gibi 2 mL et suyu içeren tüplere analit stok çözeltisi ekleyin, geçmeli kapakları gevşek olacak şekilde (tüpe hava akışına izin vermek için) kültür tüpüne yerleştirin ve kültür tüpünü vorteksleyin.
4. Çıtçıtlı kapakları kültür tüplerinin üzerinde gevşek bir şekilde bırakın ve en az 24 saat boyunca 220 rpm ve 37 °C'de çalkalayan bir inkübatöre yerleştirin.
5. Tüpleri inkübatörden çıkarın, kapakları tüplerin üzerine sıkıca oturtun ve tüpleri floresan analizi için hazır olana kadar buzdolabında saklayın.

8. E. coli'nin ateşli silah kalıntısı (GSR) için kimyasal sensör olarak kullanılması

1. Kurşunu çıkarmak için tasarlanmış etanol bazlı bir mendil kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakın), parmak araları da dahil olmak üzere ellerin tüm yüzeylerini silin. Her el için ayrı bir mendil kullanın. Mendilleri analize kadar uygun şekilde etiketlenmiş, kapatılabilir bir torbada saklayın.
2. Test edilecek yüzeyler için, geniş yüzeyler için alkol bazlı bir mendil veya küçük yüzeyler için etanol ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanın.
   NOT: Sensörlerin GSR'ye tepkisini göstermek için, kullanılmış bir .40 kalibrelik kartuş muhafazasının içi, etanolle nemlendirilmiş bir pamuklu çubukla temizlendi.
3. Temiz eldiven giyerek ve alkolle temizlenmiş makas kullanarak mendilin ortasından yaklaşık 1^cm2'lik bir bölüm kesin.
4. El mendilinin veya pamuklu çubuğun kesilen parçasını doğrudan 2 mL sensör bakterisi içeren bir kültür tüpüne yerleştirin ve et suyuna batırıldığından emin olun.
5. Yukarıda 7.4 – 7.5 adımlarında açıklandığı gibi ilerleyin.

Tablo 1. Ligasyon için reaksiyon karışımı, protokol adımı 3.1.1.

PARÇA	20 μL REAKSİYON
10X T4 DNA Ligaz Tamponu	2 μL
Plazmit DNA (3 kb)	3 μL
Promotör DNA'sı (0.7kb)	10 μL
Nükleaz içermeyen su	4 μL
T4 DNA Ligaz	1 μL

 

 

 

 

 

 

Tablo 2. Koloni PCR için reaksiyon karışımları, protokol adımı 4.1.

Parça	25 μL reaksiyon
10 μM İleri Primer	0,5 μL
10 μM Ters Astar	0,5 μL
BirTaq 2X Ana Karışım	12,5 μL
Nükleaz içermeyen su	11 μL

 

 

 

 

 

Tablo 3. Protokol adımı 4.3 için PCR termodöngü parametreleri.

ADIM	TEMP	SAAT
İlk Denatürasyon	94 °C	30 sn.
30 Döngü	94 °C	30 sn.
	55 °C	45 sn.
	68 °C	60 sn.
Son Uzatma	68 °C	5 dk
Tutmak	4 °C

 

 

 

 

 

 

 

Tablo 4. Biyosensörlerin titrasyonu için genel deney kurulumu, protokol adımı 7.2.

Tüp Kimliği	Bakteri	Eklenen analit çözeltisinin konsantrasyonu (ppm)	Metal eklendi	2.000 μL et suyuna eklenen analit çözeltisinin hacmi	[analit], ppb
1	PbRFP Hakkında	10	Pb	2.5	12
2	PbRFP Hakkında	10	Pb	75	361
3	PbRFP Hakkında	10	Pb	150	698
4	PbRFP Hakkında	0	hiç kimse	0	0
5	RFP olumsuzluk	10	Pb	10	50
6	RFP konumu	10	Pb	10	50

Malzemeler