Yöntem makalesi

Bakteriyel Yüzey Hareketliliğini Görselleştirmek için Oğul Verme Testi

26 Eylül 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Morales-Soto, N. ve ark., Bakteriyel Yüzey Hareketlilik Testlerinin Hazırlanması, Görüntülenmesi ve Miktarının Belirlenmesi. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, yumuşak agar üzerinde yüzey hareketliliğini gözlemlemek için yeşil floresan proteini eksprese eden bakterileri kullanan bir oğul testini göstermektedir. Hızlandırılmış görüntüleme, koordineli genişlemeyi ve dal oluşumunu yakalayarak bakteriyel yüzey hareketliliğini vurgular.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sürü Tahlil Ortamının Hazırlanması ve Aşılaması

  1. Medya Hazırlama
    NOT: Aşağıda açıklanan ortam bileşimi, Pseudomonas aeruginosa dal oluşumu çalışmaları için geçerlidir. Lütfen Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis ve Myxococcus xanthus yüzey hareketliliği deneyleri için Tablo 1'deki ortam özelliklerine bakın.
    1. 200 ml akışkanlaştırılmış aerobik biyo-reaktör (FAB)-eksi amonyum sülfat ((NH4)2SO4) sürü ortamı (Malzeme Tablosu), 0.9 g Noble agar ve 0.2 g Casamino asidi (Tablo 1) manyetik bir karıştırma çubuğu ile karıştırarak karıştırın. Deneyler arasındaki tutarlılığı artırmak için küçük hacimler (100-300 ml) kullanın.
    2. 200 ml agar/ortam karışımını 22 dakikalık bir maruz kalma süresi, 121.1 ° C'lik bir maruz kalma sıcaklığı ve hızlı havalandırma seçeneği kullanarak otoklavlayın. Otoklav ayarları, uygun sterilizasyona ve agar erimesine izin verecek, ancak agar karamelizasyonunu önleyecektir.
      NOT: Asil agar karamelleşmeye eğilimlidir; Karamelize agarda bakteri hareketliliği değişir.
    3. Sterilizasyon döngüsü tamamlandıktan hemen sonra, buharlaşma yoluyla su kaybını önlemek için ortam şişesinin kapağını kapatın. Ancak, sıkı kapatmanın şişe üzerinde "vakumla kapatma" benzeri bir etkiye neden olabileceğini unutmayın.
    4. Ortamı oda sıcaklığında (RT) karıştırarak 50 °C'ye soğutun ve 2 ml steril 1,2 M glikoz ekleyin. Alternatif olarak, ortamı kullanıma hazır olana kadar (15 saat sonrasına kadar) 60 °C'lik bir inkübatöre veya su banyosuna yerleştirin ve belirtildiği gibi devam edin. Ortamda kabarcık oluşumunu önlemek için manyetik karıştırma çubuğunu kullanarak iyice karıştırın; Agar yüzeyindeki kabarcıklar oğul vermeyi bile önleyecektir.
      NOT: Diğer tahliller için, bu adımda ek besinler veya boyalar gibi otoklavlanamayan ısıya duyarlı bileşenleri gerektiği gibi ekleyin (örneğin, aşağıdaki Temsili Sonuçlarda gösterildiği gibi, M. xanthus'u görüntülemek için 100 ml eritilmiş agar başına 8 μl Invitrogen Syto 63 boyası). Bazı boyaların eklenmesi, boya olmayan bir kontrole karşı kontrol edilmesi gereken temel oğul verme davranışını etkileyebilir.
    5. Bir laboratuvar başlığında, 60 mm çaplı polistiren Petri kabı başına 7,5 ml steril ortam ayırın ve plakaları tek bir katmanda (istiflenmemiş) tutun. Daha büyük bir kaynaşma yüzeyi için, 100 mm çaplı Petri kabı başına 25 ml ortam ayırın. Bulaşıkları düz bir yatay yüzeye doldurmak önemlidir. Yüzeyin düz olup olmadığını kontrol etmek için bir boğa bakışı seviyesi kullanın.
      NOT: P. aeruginosa tahlilleri için, plaka başına belirli bir ortam hacminin kullanılması tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği artıracaktır. B. subtilis ve M. xanthus tahlilleri için, elle dökme, belirli hacim alikotlarıyla karşılaştırılabilir sonuçlar verir.
  2. Plaka kürleme
    1. Küçük plakalar (60 mm) için, erimiş agar ortamının davlumbazda açıkta (yani kapaksız) 30 dakika boyunca kürlenmesine (hem yarı katı hem de kuru fazla sıvı) izin verin. Daha büyük plakalar (100 mm) daha uzun kürlenme süresi gerektirir (bkz.
      NOT: Alternatif olarak, bazı tahliller, plakaların tek bir tabaka halinde kaplanmış (yani kapaklar açık) gece boyunca (20-24 saat) tezgah üstünde kürlenmesini gerektirebilir (Tablo 1). Oğul verme hem aşırı hem de yetersiz neme karşı hassastır. Herhangi bir laboratuvarın nemi, hava akışı ve sıcaklığı, bakterinizin optimum şekilde kaynaşmasını sağlamak için plaka kürlemede değişiklik gerektirebilir.
    2. Kuruma süresi bittikten hemen sonra plakaları aşılayın. Plakaları daha sonra kullanmak üzere saklamayın.
      1. %0,50 (hacim/hacim) Higgins su geçirmez siyah çini mürekkebi ve bakteri aşısından oluşan 10 μl karışımı içeren bir test plakasını tespit ederek "mürekkep yayılma testini" gerçekleştirin. Mürekkep/aşı karışımı ortamın yüzeyinde kolayca yayılırsa (yani damlacık formunu tutmazsa), ortamın kuruması için ek zamana ihtiyacı olacaktır.
        NOT: Neme karşı özellikle hassas olan türler için (örneğin, P. aeruginosa), plakaların yeterince kuru olup olmadığını belirlemek için hızlı bir "mürekkep yayılma testi" yapın.
  3. Sürü Testi Aşılama
    1. 6 ml et suyu kültürü ortamını (ayrıntılar için Tablo 1'e bakınız) taze (oda sıcaklığında bırakılırsa < 5 günlük) Lizojeni Et Suyu (LB) plaka kültüründen izole edilmiş bir koloni ile aşılayın. Et suyu kültürlerini gece boyunca (≤18 saat) 30 °C veya 37 °C'de yatay çalkalayarak (240 rpm) inkübe edin.
    2. Sürü plakalarını 1-5 μl gece et suyu kültürü ile lekeleyerek veya agarı steril bir kürdan veya tel aşılama iğnesi ile "dürterek" aşılayın.
      NOT: İkinci yöntemi tercih ediyoruz çünkü aşının sıçrama olasılığını azaltıyor ve sürü yüzey alanına ek nem eklenmesini önlüyor.
  4. Sürü Tahlili İnkübasyonu
    1. Genel bir tahlil için, sürü tahlil plakalarını 30 °C veya 37 °C'de (hatta B. subtilis için 42 °C'de; Tablo 1)—bu bakteriye özgüdür. İnkübasyon sırasında plakaları ters çevirin, böylece fazla nem agarda değil kapakta yoğunlaşır.
      NOT: Sıcaklık fenotipi ve kinetiği etkileyebilir. P. aeruginosa sürüleri için 37 °C'de inkübasyon, 30 °C'de inkübasyona göre daha hızlı büyümeye ve sürü genişlemesine yol açar; Bununla birlikte, bu sürülerin morfolojisi genellikle sıcaklıktaki bu değişiklikle farklılık gösterir.
    2. Hızlandırılmış görüntüleme için, sürü plakalarını görüntüleme istasyonuna aktarmadan önce uygun sıcaklıkta inkübe edin (ayrıntılar için Tablo 1'e bakın).
      NOT: Bu ön görüntüleme inkübasyonu, sürülerin gelişimlerine başlamalarına ve yeni bir ortama taşınmadan önce yerleşmelerine izin verir, bu da oğul hareketliliği için optimal olabilir veya olmayabilir.

2. Yüzey Motilite Deneylerinin Makroskopik Görüntülenmesi

  1. Hızlandırılmış görüntüleme için, ön görüntüleme inkübasyon süresinden sonra, sürü tahlil plakalarını ticari bir in vivo görüntüleme istasyonunun içindeki şeffaf bir görüntüleme plakasına yerleştirin. Bir seferde altı, 60 mm çapında veya dört, 100 mm çapında plaka görüntü. Kamera, görüntüleme düzleminin altından görüntü yakaladığından, optik yolun engellenmemesi için plakaları ters çevirin. Alternatif olarak, deney süresince 30 °C veya 37 °C'de (Tablo 1) inkübe edin ve görüntülenecek plakaları belirli zaman aralıklarında inkübatörden çıkarın.
  2. Petri kaplarının kapaklarını, aşılanmış ortamı tutan plaka muadilinin üzerine dik olarak yerleştirin. Görüntüleme sırasında aşırı kurumayı önlemek için Petri kaplarının kapaklarını suyla doldurun ve deney boyunca nemi korumak için tüm kurulumu başka bir şeffaf tepsi kullanarak kapatın.
  3. Moleküler Görüntüleme (MI) yazılımını kullanarak, Tablo 2'de açıklanan görüntüleme ayarlarını kullanarak tahlil(ler)i oda sıcaklığında çalıştırın. Hızlandırılmış görüntüleme için gerekli adımları ve spesifikasyonları içeren bir protokol oluşturun.

Tablo 1: Yüzey Hareketlilik Testi Hazırlama Spesifikasyonları. P. aeruginosa, B. subtilis ve M. xanthus için yüzey hareketliliği tahlili hazırlama spesifikasyonlarını içerir.

 P. aeruginosaP. aeruginosa dal oluşumu çalışmalarıB. subtilisM. xanthus
Gecelik et suyu kültürü ortamıFAB artı 30 mM GlikozFAB artı 30 mM GlikozLBCTT (karmaşık ortam)
Gecelik et suyu kültürü inkübasyon sıcaklığı37 °C37 °C37 °C30 °C'de 30 saat
Sürü ortamıFABFAB eksi (AH4)2SO4%2 (ağırlık/hacim) LBCTT
Sürü ortamı: ek bileşenler12 mM Glikoza%10 (ağırlık/hacim) Kaamino asitler (CAA), 12 mM GlikozaYokSYTO® 64a
Agar türüAgar, AsilAgar, AsilGranül agarAgar, Asil Affymetrix
Agar konsantrasyonu (ağırlık/hacim)0.45%0.45%0.60%1.50%
Sürü plakası boyutu60 mm60 mm100 mm150 mm
Plaka başına medya hacmi7,5 ml7,5 mlEl DökümüEl Dökümü
Sürü ortamı ayarlama/kurutma yöntemiKaput; Ortaya çıkan plakalarKaput; Ortaya çıkan plakalarTezgah üstü plakalar kaplıTezgah üstü plakalar kaplı
Sürü ortamı ayarı/kuruma süresi30 dk30 dkGeceleme (20 -24 saat)Geceleme (20 -24 saat)
Sürü tahlili inkübasyon sıcaklığı30 veya 37 °C30 °C37 °C30 °C
Hızlandırılmış görüntüleme için kuluçkaEn az 4 saat boyunca 30 °CEn az 4 saat boyunca 30 °C2 saat boyunca 37 °C12 saat RT
Hızlandırılmış çekim uzunluğu24 saat24 saat10 saat66 saat
Hızlandırılmış çekim ayarı1 kare/10 dk1 kare/10 dk1 kare/6 dk1 kare/10 dk
a Otoklavlamadan sonra eklendi.  

 

Tablo 2: Görüntüleme Spesifikasyonu. Bakteriyel yüzey büyümesinin kırmızı ve yeşil floresan ve lüminesans görüntülemesi için Bruker görüntüleme istasyonu özellikleri.

SinyalYeşil FloresanKırmızı Floresan IKırmızı Floresan IILüminesans
Protein veya boyaYeşil Floresan Protein (GFP)mKiraz proteini veya Nil Kırmızısı ramnolipid boyasıSYTO® 64 Lux operonundan lusiferaz
Uyarma dalga boyu (nm)480 ± 10540 ± 10590 ± 10Kapalı
Emisyon dalga boyu (nm)535 ± 17.5600 ± 17.5670 ± 17.5Filtre yok
Pozlama süresi (sn)306060240
f-durağı4.04.02.51.1
Görüş Açısı (mm)190190140120
Odak düzlemi (mm)27.527.512.24
Gruplama (piksel)Hiç kimse2 x 2Hiç kimse8 x 8

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler:    
FAB minimal medya:   Her ~4 haftada bir hazırlayın. Nanosaf H2O ile 1 L'ye kadar.
(NH4)2ÇOK4SigmaA4418 Serisi2 grP. aeruginosa dal oluşumu çalışmalarında kullanılmaz.
Na2HPO4 x 7H2OSigma-AldrichS9390 Serisi9 gr 
KH2PO4SigmaP56553 gr 
NaClBDHBDH80143 gr 
MgCl2 x 6H2Oçözeltisi (198 g/L)Fisher BilimselM33 Serisi1 ml 
CaCl2 x 2H2O çözeltisi (14 g/L)Fisher BilimselC791 ml 
Eser metal çözeltisi (aşağıya bakın)YokYok1 ml 
     
Eser metal çözümü:   Nanosaf H2O ile 1 L'ye kadar Bir cam şişede karıştırın ve folyo ile kaplayın.
CaSO4 x 2H2OSigma-Aldrich255548200 mg 
MnSO4 x H2OSigma-AldrichM7634 Serisi20 mg 
CuSO4 x 5H2OFisher BilimselC493 Serisi20 mg 
ZnSO4 x 7H2OSigma-AldrichZ4750 Serisi20 mg 
CoSO4 x 7H2OSigma-AldrichC6768 (İngilizce)10 mg 
NaMoO4 x 2H2OSigmaS6646 Serisi10 mg 
H3BO3Fisher BilimselA745 mg 
FeSO4 x 7H2OSigma-AldrichF7002 Serisi200 mg 
     
CTT medyası:   Gerektiği gibi hazırlayın. Nanosaf H2O ile 100 ml'ye kadar.
Tris-HCl, 1 M çözelti (pH 8.0'a ayarlayın)Amresco2341 mlNano safH2O'da 1 M'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. pH'ı 8,0'a ayarlayın ve filtreyle sterilize edin (0,2 μm gözenek).
K2HPO4, 1 M çözelti (pH 7,6'ya ayarlayın)Sigma-AldrichP37860,1 mlNano safH2O'da 1 M'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. pH'ı 7,6'ya ayarlayın ve filtre sterilize edin (0,2 μm gözenek).
MgSO4 çözeltisiFisher BilimselM65 Serisi0,8 mlNano safH2O'da 1 M'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Filtre sterilize edin (0,2 μm gözenek).
CasitoneBD Teşhisi2259301 gr 
     
Ek reaktifler:    
LB Et Suyu, LennoxBD Teşhisi240230%2 (ağırlık/hacim) 
D-(+)-GlikozSigma-AldrichG5767 SerisiGece et suyu kültürleri için 30 mM; Sürü ortamı için 12 mMNano saf H2O içinde 1,2 M filtre ile sterilize edilmiş bir stok çözeltisi hazırlayın. Otoklavlamadan sonra ortama ekleyin.
Casamino asitler (CAA)AmrescoJ851 Serisi%0,10 (ağırlık/hacim)P. aeruginosa dal oluşumu çalışmaları için önerilir. Otoklavlamadan önce ortama ekleyin.
Agar, AsilSigma-AldrichA5431 Serisi%0,45 (ağırlık/hacim)P. aeruginosa yüzey hareketliliği çalışmaları için tercih edilen Noble agar. Otoklavlamadan önce ortama ekleyin.
Agar, AsilAffymetrix10907%1,50 (ağırlık/hacim)M. xanthus yüzey hareketliliği çalışmalarında kullanılır. P. aeruginosa motilite çalışmaları için önerilmez. Otoklavlamadan önce ortama ekleyin.
Agar, GranülFisher BilimselBP1423 Serisi%0,60 (ağırlık/hacim) 
Higgins su geçirmez siyah Hindistan mürekkebiHigginsHIG44201%0,50 (hacim/hacim)Sürü ortamı yüzey nemini test etmek için mürekkebi aşıyla karıştırın.
SYTO® 64 kırmızı floresan nükleik asit boyasıDavetliS-11346 100 ml erimiş agar (otoklavlamadan sonra eklenir) başına 4 ul ( P. aeruginosa için) veya 8 ul ( M. xanthus için) SYTO® 64 kullanın.
     
İlgili malzeme ve ekipmanlar:    
Petri kabı, steril, 150 mm x 15 mm (Çap x Y)VWR25384-326  
Petri kabı, steril, 100 mm x 15 mm (Çap x Y)VWR25384-342  
Petri kabı, steril, 60 mm x 15 mm (Çap x Y)VWR25384-092  
Vivo XtreamBruker  Yüzey hareketliliği çalışmalarının makroskopik görüntülemesi için kullanın. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Swarming AssayBacterial MotilitySoft AgarTime lapse ImagingGreen Fluorescent ProteinTendril FormationImage AnalysisInoculation TechniqueHumidity ControlImaging System

İlgili makaleler