Streptomyces'te Gelişimsel Mutantların Değerlendirilmesi için Faz Kontrast Mikroskobu

Abstract

Kaynak: Bennett, J. A. ve diğerleri. Streptomyces Gelişimsel Mutantlarının Görsel ve Mikroskobik Değerlendirmesi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, vahşi tip ve mutant Streptomyces coelicolor arasındaki fenotipik farklılıkları incelemek için faz kontrast mikroskobunun kullanımını göstermektedir. Spor oluşumundaki gelişimsel kusurları tespit etmek için hava filamentlerinin hazırlanması ve görüntülenmesiyle ilgili adımları özetlemektedir.

Protocol

1. Faz Kontrast Mikroskobu Yapın

1. Cımbızı %70 etanolde yıkayarak ve ardından etanolü buharlaştırmak için bir Bunsen brülör alevinden geçirerek sterilize edin. soğumaya bırakın.
2. Lamelleri %70 etanol içinde yıkayarak ve ardından steril bir Petri kabında kurumaya bırakarak sterilize edin.
3. İncelenecek bakteri üremesinin lamel kaldırmasını hazırlayın.
   1. Steril cımbızla steril bir lamel alın ve lamel Streptomyces coelicolor bakteri üremesinin yoğun olduğu bir mannitol soya unu (MS) agar plakasına yerleştirin. Bakteri sporlarının ve hava miselyumunun yeterli transferini sağlamak için lamel arkasına cımbızla hafifçe bastırın.
4. Lameli plakadan alın ve hücre materyalinin bulunduğu taraf, montaj için suda hazırlanmış 15 μL'lik %50 gliserol damlatılarak bir mikroskop lamının yüzeyine bakacak şekilde yerleştirin. Lameli slayta 45° açıyla yerleştirerek ve %50 gliserolün üzerine düşmesine izin vererek hava kabarcıklarını azaltın.
5. (İsteğe bağlı) Slaytın korunması için şeffaf oje ile kapatın.
6. Yaşam döngüleri boyunca çeşitli zaman aralıklarında faz kontrast mikroskobu gerçekleştirin.
   NOT: Tekrarlanan görüntüleme, daha eksiksiz bir analiz ve gelişimdeki gecikmeleri tespit etme yeteneği sağlar. Doğruluk ve tekrarlanabilirlik sağlamak için gözlemleri bağımsız olarak tekrarlayın.
   1. Hazırlanan lamı mikroskop tablasına yerleştirin ve lamel ortasına bir damla daldırma yağı ekleyin. 100X faz objektifini yerine döndürün ve kondenser taretini uygun "eşleşen" faz ayarına getirin. Objektif merceği yağla temas ettiğinde yalnızca ince ayar düğmesini kullanarak görüntüyü odaklayın.
   2. Mutant suşlar ile vahşi tip arasındaki spor oluşturma yeteneği, spor boyutu ve şekli ve toplam spor sayısı gibi gözle görülür ve tutarlı farklılıkları ayırt etmek için çeşitli görüş alanlarını inceleyin (bkz. Şekil 1).
      NOT: Faz kontrast mikroskobuna alternatifler arasında diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskobu ve kristal mor boyama gibi parlak alan mikroskoplarıyla kullanım için basit boyama teknikleri bulunur.

Results

Şekil 1: Rastgele transpozon yerleştirme mutasyonları içeren Streptomyces coelicolor beyaz mutant suşları için temsili bir hava filamentini gösteren faz kontrastlı mikrograflar. (A) Gös...

Materials