Konakçı Bakterilerle İkili Sakkaribakteri Kültürünün Oluşturulması

Özet

Kaynak: Collins, A.J., ve diğerleri, Ağız Boşluğundan Simbiyotik Sakkaribakterilerin Kararlı İkili Kültürlerinin Oluşturulması. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, Saccharibacteria ve konakçı bakterisinin ikili kültürünün, konakçıya özgü büyüme ortamında sırayla birlikte inkübe edilerek kurulmasını ve sürdürülmesini göstermektedir.

Protokol

1. Santrifüjleme ile Sakkaribakteri hücrelerini konsantre edin
   1. Tüp ve kapak üzerinde bir yönlendirme işareti yapın ve tüpü, üst tarafında işaret olacak şekilde yüksek hızlı bir santrifüje yerleştirin. Santrifüjlemeden oluşan pelet genellikle görünmezdir. İşaretleme, santrifüjleme yapıldığında ve tüp santrifüjden çıkarıldığında Saccharibacteria hücrelerinin peletinin nerede bulunduğunu belirlemeye yardımcı olacaktır.
   2. Numuneleri 4 °C'de 1 saat boyunca 60.000 x g'da santrifüjleyin.
      NOT: Bu kuvvet ve süre, tüm Sakkaribakteri hücrelerini pelet etmek için yeterlidir. Bununla birlikte, Sakkaribakteri hücreleri, 20.000 x g'da 20 dakika kadar kısa bir süre santrifüjlenerek en azından kısmen peletlenebilir.
   3. Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın. Peleti tüpün üst tarafında tutarak sıvıyı tüpten boşaltın.
   4. Genellikle görünmeyen peleti, kuvvetli vorteksleme ile 1-2 mL MRD (Maksimal geri kazanım seyreltici) tamponunda yeniden süspanse edin.

2. Konakçı kültürleri Sakkaribakterilerle zenginleştirilmiş süzüntü ile enfekte edin

1. 2 mL uygun büyüme ortamını (örneğin, TSBY (% 0.1 maya özü içeren Triptik soya suyu), BHI (Beyin Kalp İnfüzyonu), vb.) tüplere ayırarak kültür tüplerini hazırlayın.
2. Her tüpe 200 μL konakçı organizmaların gece kültürü ekleyin. Her tüpe 100-200 μL yeniden süspanse edilmiş, filtrelenmiş numune ekleyin.
3. Kombine numuneleri konakçı organizma için uygun şekilde inkübe edin (örneğin, 37 °C, Arachnia propionica için aerobik bir atmosferde).
4. 200 μL ikili kültürü yeni bir tüpte 2 mL taze büyüme ortamına aktararak hücreleri her iki ila üç günde bir geçirin. Geçişli kültürlerin büyüme göstermediği görülüyorsa (yani, taze ortama geçtikten sonra kültürün bulanıklığı/optik yoğunluğu artmıyorsa), Sakkaribakteriler tüm konakçı organizmaları eziyor veya öldürüyor olabilir. Bunu düzeltmek için, hücreleri geçerken 200 μL enfekte olmamış konakçı kültürü ekleyin. En az 5 pasaj için tekrarlayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Beyin Kalp İnfüzyon Suyu (kurutulmuş toz)	Becton-Dickinson Hakkında	211059	Veya hedef organizmalar için uygun diğer büyüme ortamları
Santrifüj Rotoru 70-Ti	Beckman Coulter	337922
2 Kontrol InVitro Torpido Gözü	Nazlı Laoratoryler	31615	Mikroaerobik organizmalar için gerekirse
Optima L-100 XP Yüksek Hızlı Santrifüj	Beckman Coulter	8043-30-1124
P-1000 mikro pipet	Gilson'ın	F123601G
P-200 mikro pipet	Gilson'ın	F123602G
PBS (Fosfat tamponlu salin)	Fisher Bilimsel	BP399500
Pepton	Fisher Bilimsel	BP1420-500 Serisi
Pipet uçları - 1000 μL	Fisher Bilimsel	02-717-166
Pipet uçları - 200 μL	Fisher Bilimsel	02-717-165
Vidalı kapaklı konik santrifüj tüpleri 15 mL	Doğan	352096	Veya bakteri kültürü için uygun başka bir tüp
Kalın Duvarlı Polikarbonat 25 x 89 mm (26,3 mL kapasiteli) kapaklı santrifüj tüpleri	Beckman Coulter	355618
Triptik Soya Kanlı Agar Plakaları	Kuzeydoğu Laboratuvar Hizmetleri	P1100 Serisi	Veya konakçı organizmaların büyümesi için yeterli olan başka bir agar plakası
Triptik Soya Suyu (kurutulmuş toz)	Becton-Dickinson Hakkında	211825	Veya hedef organizmalar için uygun diğer büyüme ortamları
Maya Özü	Fisher Bilimsel	BP1422-500 Serisi