Bir Agar Kültüründen Sülfit İndirgeyen Anaerobik Bakterilerin Alt Kültürlenmesi

Özet

Kaynak: Anwar, Z., ve diğerleri. Perakende Gıda Örneklerinde Clostridium perfringens Toksinotiplerinin Zenginleştirilmesi ve Tespiti. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, sülfit indirgeyen bakteriler, sülfit içeren bir agar ortamında kültürlenir, burada anaerobik olarak büyürler ve sülfiti hidrojen sülfüre indirgeyerek demir iyonları ile siyah çökeltiler oluştururlar. Siyah koloniler, aseptik teknikler kullanılarak agar derinliğinden izole edilir ve sürekli anaerobik inkübasyon için taze ortama aktarılır.

Protokol

NOT: Clostridium perfringens , biyogüvenlik tehlike seviyesi 2 (BSL2) organizma olarak kabul edilir. Tüm gıda numuneleri C. perfringens içermese de, kültürlenmiş tüm numuneler bu şekilde ele alınmalıdır. Tüm uygun önlemler ve personel koruyucu ekipman (KKD) her zaman giyilmelidir. Bertaraf etmeden önce tüm malzemeleri dekontamine edin.

1. Modifiye edilmiş RPM'yi (Hızlı perfringens ortamı) hazırlayın

1. 30 g/L sıvı tiyoglikolat ortamı, 60 g/L jelatin, 5 g/L pepton, 5 g/L glikoz, 5 g/L potasyum fosfat dibazik, 3 g/L maya ekstraktı, 1,5 g/L sodyum klorür, 0,5 g/L demir sülfatı deiyonize suda eşit şekilde dağılana kadar birleştirin. Genellikle 1 L'lik partiler yaparız.
2. 121 °C'de 15 dakika otoklavlayın.
3. Yaklaşık 40 °C'ye soğumaya bırakın.
4. RPM soğuduğunda, 440 mg/L'lik nihai konsantrasyona kadar D-sikloserin ekleyin.
   NOT: Steril suda 50 mg / mL'de çözünmüş D-sikloserin stok konsantrasyonları, ileride kullanılmak üzere -20 ° C'de saklanabilir.
5. 10 mL RPM'yi 15 mL konik tüplere aseptik olarak aktarın. RPM partiler halinde hazırlanabilir ve 4 °C'de bir aya kadar saklanabilir.
6. Kullanmadan önce RPM'yi 37 °C'ye ısıtın.

2. Numune toplama ve RPM inkübasyonu

1. Yiyecekleri 1 saat içinde ortam sıcaklıklarında laboratuvara taşıyın. Gıdalar orijinal ambalajında veya steril kaplarda taşınabilir. Hemen test edilmezse, yiyecekler kullanıma kadar -20 °C'de saklanabilir. Varsa, ambalaj etiketine göre gıdanın türünü ve menşe ülkesini ve diğer ilgili bilgileri not edin.
2. Yaklaşık 1.0-2.0 g yiyeceği çıkarın ve steril bir Petri kabına veya eşdeğerine aktarın. Steril bir tıraş bıçağı veya neşter ile ince kıyın.
3. 15 mL'lik konik bir tüpte 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içine aşılayın. İyice karıştırın.
   1. Bitkisel hücreleri seçmek için, 5 mL PBS-gıda karışımını 10 mL RPM içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Kapağı sıkıca sabitleyin.
   2. Sporları seçmek için, kalan 5 mL PBS-gıda karışımını 85 °C'de 15 dakika ısıtın ve ardından 10 mL RPM içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Kapağı sıkıca sabitleyin.
4. Tam karıştırmayı sağlamak için gıda-RPM kültürlerini vorteksleyin ve ters çevirin.
5. Anaerobik bir ortam sağlamak için konik tüpleri sıkıca kapatın ve kapakları parafin film veya plastik ambalajla sarın.
6. Gece boyunca (AÇIK) 37 °C'de inkübe edin.
7. Ertesi sabah, RPM tüplerinde herhangi bir bulanıklık veya fermantasyon olup olmadığına dikkat edin.

3. TSC (Triptoz Sülfit Sikloserin) "sandviç" kaplama

1. ON RPM kültürlerini aşağıda açıklanan bir "sandviç" tekniği (Şekil 1) kullanarak TSC agara aşılayın.
2. TSC agarı üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
   1. 10 mL erimiş TSC agarı steril Petri kaplarına aktararak TSC plakalarının taban katmanını hazırlayın ve katılaşmasına izin verin. Bunlar önceden hazırlanabilir ve 4 °C'de saklanabilir. Kullanmadan önce plakaların oda sıcaklığına ısıtıldığından emin olun.
   2. TSC plakasının üst tabakası için kalan erimiş TSC agarı 40 °C'de tutun.
      NOT: Agarın erime noktası 85 °C'nin üzerinde olmasına rağmen, erimiş agar 32-45 °C civarında katılaşır.
3. ON RPM kültürlerini dikkatlice alın ve 100 μL'yi TSC agar bazına aktarın. Fermantasyon nedeniyle bazı kültürler baskı altında olabilir. Tüm uygun KKD'leri giydiğinizden emin olun.
4. RPM aşısını sterilize edilmiş cam boncuklar veya hücre yayıcı kullanarak yayın.
5. RPM'nin oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca TSC agar içine "emilmesine" izin verin.
6. 20 mL erimiş, 40 °C TSC agarı serolojik bir pipet kullanarak dikkatlice plakaya aktarın.
7. Petri kabı kapağını değiştirin ve TSC agarın oda sıcaklığında tamamen katılaşmasına izin verin.
8. Petri kabını ters çevirin ve 37 °C'de inkübe edin.
9. Seri seyreltmeler isteniyorsa, TSC agara aşılamadan önce ON RPM kültürlerinin taze, önceden ısıtılmış RPM'ye seyreltilmesini gerçekleştirin.

4. Sülfit indirgeyen kolonilerin alt kültürlenmesi

1. Ertesi sabah, plakaları inkübatörden çıkarın ve bakteri üremesi olup olmadığını inceleyin. Agarın yüzeyinde aerobik bakteriler bulunabilir. Agarın içine gömülü olarak büyüyen anaerobik bakteriler bulunacaktır. Sülfit indirgeyen bakteriler çevredeki agarı siyaha çevirecektir. Olası C. perfringens kolonileri siyah olacak ve agara gömülecektir.
2. C. perfringens şüpheli koloniler sülfit indirgemesi için pozitif olacak ve agar içine gömülü siyah görünecektir. Steril, tek kullanımlık bir damlalık kullanarak, siyah kolonileri agardan "koparın" ve 15 mL'lik konik bir tüpte 10 mL taze RPM'ye aktarın. Agar delmeden önce damlalıktaki havanın dışarı atılması önemlidir.
3. Plakanın yüzeyinde yoğun miktarda aerobik bakteri üremesi varsa, seçilen alanlardan kolonileri çıkarmak için steril bir hücre kazıyıcı kullanın. Birden fazla C. perfringens şüphesi olan koloniler, aynı TSC plakasından ayrı RPM kültürlerine örneklenebilir.
4. Konik tüp kapaklarını sıkıca sabitleyin ve parafin film veya plastik sargıya sarın. 37 °C'de AÇIK inkübe edin.

Sonuçlar

Şekil 1: TSC agar sandviç tekniğinin şeması.

C. perfringens bakterilerini içeren RPM ortamı, anaerobik bir ortamı teşvik etmek için iki TSC agar tabakası arasına kaplanır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
D-Sikloserin	Sigma-Aldrich	C6880 Serisi
Dekstroz	Sigma Yaşam Bilimleri	D9434-250G
Tek Kullanımlık Transfer Pipetleri	Herhangi bir marka		Thermo Scientific Tek Kullanımlık Transfer Pipetleri 137116M/EMD gibi ince uçlu olanı seçin
DNeasy Kan & Doku Kitleri	Qiagen	69504	Not: Çok sayıda DNA ve plazmit ekstraksiyon kiti değerlendirildi, bu kit en çok arzu edilen sonuçları verdi.
Kuru İnkübatör	Herhangi bir marka
Sıvı tiyoglikolat ortamı	Remel	R453452
Domuz derisinden jelatin	Sigma Yaşam Bilimleri	G1890-500G
Demir (II) sülfat heptahidrat	Sigma Yaşam Bilimleri	F8633-250 G
Tavuk yumurtası beyazından lizozim	Sigma-Aldrich	L6876 Serisi	DNA ekstraksiyonu için gereklidir, kitte sağlanmaz
Parafilm veya plastik sargı	Herhangi bir marka
Kazein ve diğer hayvansal proteinlerden elde edilen pepton	Sigma-Aldrich	70173-100G
Perfringens Agar Tabanı (TSC + SFP)	Oksoid	CM0587 Serisi	TSC agarı talimatlara göre yapın
Potasyum fosfat dibazik	Sigma-Aldrich	P2222-100G
Sodyum klorür	Sigma-Aldrich	S-7653
Steril Hücre Kazıyıcı	Herhangi bir marka
Steril hücre Yayıcı	Herhangi bir marka
Steril petri kapları	Herhangi bir marka
Maya özü	Sigma-Aldrich	70161-100G