Stres Kaynaklı Bakterilerden İzole Edilen (p)ppGpp Nükleotidlerinin İnce Tabaka Kromatografisine Dayalı Ayrılması

Abstract

Kaynak: Fernández-Coll, L. ve Cashel, M. Escherichia coli (p)ppGpp'nin Çoklu İn Vivo Ölçümleri ve ardından İnce Tabaka Kromatografisi için Mikrotitre Çanak Radyoetiketleme Kullanma. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, ince tabaka kromatografisi (TLC) kullanarak bakteriyel stres tepkisi nükleotidleri ppGpp ve pppGpp'nin seviyelerini ve dinamiklerini ölçmek için yüksek verimli bir protokol sunar. Yöntem, çeşitli stres koşulları altında bakteri kültürlerinde (p)ppGpp'nin miktarının belirlenmesine yönelik güçlü, hızlı ve uygun maliyetli bir yaklaşım sağlayarak bakteri fizyolojisinin yüksek çözünürlüklü analizine ve sıkı tepkiye olanak tanır.

Protocol

1. İnce Tabaka Kromatografisi
   1. Yumuşak bir kalemle, üstten 5 cm çıkarılmış 20 cm x 20 cm Polietilenimin-Selüloz (PEI-selüloz) ince tabaka kromatografi (TLC) plakasının kenarından 1 cm uzakta bir başlangıç çizgisini makasla işaretleyin. Her numune için PEI yüzeyine damlacık olarak 5 μL uygulayın. Bu noktanın kurumasına izin vermeden artan gelişime başlayın, bu da çizgileri en aza indirerek çözünürlüğü artırır.
   2. 1,5 M KH_tabakasınasahip bir tankta artan geliştirme yapın 2 PO₄ (pH 3,4) çözelti sıvının orijin numune noktasına temas etmemesi için yeterince sığ. Depoyu hava geçirmez bir conta ile kapatın ve sıvının kesilmiş tabakanın üstüne 15 cm yükselmesine izin verin. 1,5 M KH₂PO₄ çözeltisi için pH 3.4 elde etmek için, H₃PO₄ ekleyerek pH'ı ayarlamak gerekir .
   3. Tamamen gelişmiş kromatogramı çıkarın ve oda sıcaklığında havayla kurutun.
   4. Serbest ³²P içeren kromatogramın üst (pH ön) kısmını kesin ve radyoaktif atık haline getirin. Bu kısım Şekil 1'de sarı renkle temsil edilmiştir ve UV ışığı altında kolayca görselleştirilebilir. Yalnızca guanozin trifosfattan (GTP) daha yavaş göç eden (p)ppGpp nükleotidleri ölçülüyorsa, UV'de görülebilen bir GTP standardının çalıştırılması ve ardından daha büyük bir üst kısmın ( Şekil 1'de gösterildiği gibi GTP'nin üzerindeki herhangi bir şey) kesilip atılması önerilir.
   5. Otoradyografik filmleri bir fosfor ekranla gece boyunca pozlayın.
   6. Filmi geliştirin. Fosfor ekran sinyalini bir fosfor görüntüleyici ile yakalayın ve ölçün.
       
2. (p)ppGpp'nin nicelleştirilmesi
   1. Görüntü J ile radyoaktif noktaları ölçün.
      NOT: (p)ppGpp miktarı, her numunede gözlenen toplam G nükleotid miktarına normalleştirilebilir (Şekil 1). Arka plan miktarı homojen ise, arka planı düzeltmek için tek bir boşluk ( Şekil 1'den kutu 4) çıkarılabilir. Toplam G, tespit edilen GTP + ppGpp + pppGpp'nin toplamıdır. Bu normalleştirme, guanozin monofosfat (GMP) ve guanozin difosfat (GDP) seviyelerinin ihmal edilebilir olduğunu varsayar ve bu Escherichia coli için geçerlidir. Belirli bir nükleotidin toplam G'ye oranı, uygulanan numune hacmindeki değişiklikleri düzeltmek için önemli bir yol sağlar.

Results

Şekil 1: Temsili TLC analizi. TLC ile gece boyunca otoradyografi ve fosfor taramasından sonra elde edilen sonuçların şematik gösterimi. Ölçülecek noktalar kırmızı ile gösterilmiştir. ppGpp'nin kesirli miktarını hesaplama formülü de ...

Materials