Dev Veziküller İçinde Tek Hücreli Bakteri Kültürü

Bu makalede

Özet

Kaynak: Morita, M., ve diğerleri. Dev Veziküllerin İçinde Tek Hücre Düzeyinde Bakteriyel Hücre Kültürü. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, desteklenen bir lipid çift tabakasına sabitlenmiş dev veziküller içinde kapsüllenmiş tek tek bakteri hücrelerinin kültürlenmesi ve gözlemlenmesi için bir yöntem göstermektedir. Sistem, sınırlı, fizyolojik olarak ilgili bir mikro ortamda tek hücreli büyüme dinamiklerinin kararlı, uzun süreli görüntülenmesini sağlar.

Protokol

1. Dev vezikül (GV) Gözlem Sisteminin (Bakteriyel Hücre Kültürü Sistemi) hazırlanması

Destekli bir çift katmanlı membran oluşturmak için küçük veziküllerin (SV'ler) hazırlanması
1. 20 μL POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin) çözeltisi ve 4 μL biotin-PEG-DSPE (1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[biyotinil(polietilenglikol)-2000) çözeltisini bir cam tüpe dökün.
2. Bir lipit filmi oluşturmak için organik çözücüyü hava akışıyla buharlaştırın ve organik çözücüyü tamamen buharlaştırmak için bu numuneyi 1 saat boyunca bir desikatöre yerleştirin.
3. Cam şişeye 1x LB (Luria-Bertani et suyu) ortamında (GV'lerin dış sulu çözeltisi) 200 μL 200 mM glikoz ekleyin.
4. Cam şişenin açılış kısmını filmle sarın ve en az 1 saat boyunca ultrasonik bir banyoda (120 W) sonikasyon yapın.
5. SV'leri bir mini ekstrüder ve 100 nm gözenek boyutuna sahip polikarbonat membran kullanarak ekstrüzyon yöntemiyle hazırlayın.
El yapımı bir odanın hazırlanması
1. Çift yüzlü bir conta (10 mm x 10 mm x 1 mm) üzerine içi boş bir zımba ile 7 mm'lik bir delik açın.
2. Çift yüzlü contayı delikli bir kapak camına yapıştırın (30 mm x 40 mm, kalınlık 0,25–0,35 mm).
Hazne deliğindeki kapak camı üzerinde destekli çift katmanlı bir membranın hazırlanması
1. Odanın deliğine (bölüm 2.2'de hazırlanmıştır) 30 μL SV çözeltisi ekleyin ve RT'de 30 dakika inkübe edin.
2. Pipetleme yoluyla deliği 200 mM glikoz (GV'lerin dış sulu çözeltisi) içeren 20 μL 1x LB ortamıyla iki kez nazikçe yıkayın.
GV'lerin hazne deliğindeki kapak camı üzerindeki desteklenen çift katmanlı membran üzerinde immobilizasyonu
1. GV'lerin dış sulu çözeltisi (1 mg / mL) ile 10 μL nötravidin deliğe sürün ve RT'de 15 dakika inkübe edin.
2. Pipetleme yoluyla deliği 200 mM glikoz (GV'lerin dış sulu çözeltisi) içeren 20 μL 1x LB ortamıyla iki kez nazikçe yıkayın.
3. GV'leri içeren tüm çözeltiyi haznenin deliğine ekleyin ve bir kapak camı (18 mm x 18 mm, kalınlık 0,13–0,17 mm) ile kapatın (Şekil 1b).
GV'lerin içindeki bakteri hücre büyümesinin mikroskobik gözlemi
1. Uzun çalışma mesafesine sahip 40x/0.6 sayısal açıklıklı (NA) objektif lens ile donatılmış ters mikroskoplu mikroskobik bir ısıtma aşaması sistemi ayarlayın (Şekil 1b).
2. Hazneyi mikroskobik ısıtma aşamasına yerleştirintage sistem (Şekil 1b). Bakteri hücreleri içeren GV'leri 37 °C'de 6 saat statik koşullar altında odada inkübe edin.
3. Bilimsel bir tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) kamera kullanarak her 30 dakikada bir GV'ler içindeki bakteri hücresi büyümesinin mikroskop görüntülerini yakalayın ve kaydedin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1: GV'lerin içindeki bakteri hücre kültürünün gözlem sistemi. (a) GV'ler, kapak camına biyotin-nötravidin bağlanması yoluyla desteklenen bir membran üzerinde immobilize edilir. GV'ler bir ısıtma sistemi tarafından inkü...