Etilen Salan Bir Bileşik Kullanarak Etilene Bakteriyel Tepkinin Araştırılması

Bu makalede

Özet

Kaynak: Augimeri, R. V. ve diğerleri, Bakterilerde Etilen Tepkisini İncelemek İçin Bir Araç Olarak Etilen Salan Bileşik 2-Kloroetilfosfonik Asitin Kullanılması. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, 2-kloroetilfosfonik asit (CEPA) tarafından üretilen etilenin bakteri üremesi ve selüloz üretimi üzerindeki etkisini göstermektedir. Etilen, selüloz sentezini uyaran sinyal yollarını aktive ederek pelikül oluşumunun artmasına neden olur. Bu sonuçlar, etilene bakteriyel tepkiyi vurgulamaktadır.

Protokol

Pelikül Testleri
1. Komagataeibacter xylinus Başlangıç Kültürlerini Üç Kopya Halinde Büyütün ve Ölçün:
  1. Üç kopya halinde, tek bir Komagataeibacter xylinus kolonisini, %0.2 (h/h) filtreyle sterilize edilmiş selülaz ile desteklenmiş 5 ml Schramm ve Hestrin (SH) ortamına (pH 5) aşılayın. Kültürleri 30 °C'de 150 rpm'de çalkalayarak 600 nm'de (OD₆₀₀) 0,3 ila 0,4'lük bir optik yoğunluğa ulaşılana kadar (yaklaşık 72 saat) inkübe edin.
  2. Başlangıç kültürlerini santrifüjleme ile hasat edin (2.000 x g; 4 °C; 10 dakika). Hücreleri iki kez 5 ml steril salin ile yıkayın ve hücre peletini yeniden süspanse edin. Hücreleri buz üzerinde tutun.
  3. Bir Petroff-Hausser sayım odası kullanarak hücreleri ölçün.
2. 24 oyuklu Plakaları Aşılamak için Ana Karışımları Hazırlayın:
  1. Sırasıyla 0.01, 0.1 ve 1.0 mM'lik nihai CEPA konsantrasyonlarını elde etmek için 60 ml SH ortamını (pH 7) 120 ul 5, 50 ve 500 mM 2-kloroetilfosfonik asit (CEPA) stokları ile destekleyin. CEPA'yı çözmek için kullanılan 120 ul çözücü ile 60 ml SH ortamı (pH 7) daha ekleyin. Karıştırmak için girdap.
  2. Her 60 ml CEPA içeren ortamı dört adet 14 ml'lik alikota bölün. 14 ml'lik alikotlardan üçünü, 10⁵ hücre/ml'lik bir konsantrasyonda starter kültürün biyolojik kopyaları ile aşılayın. Selüloz üretimini önlemek için hücreli tüpleri buz üzerinde tutun.
    NOT: Kalan 14 ml'lik kısım steril kontrol kuyuları için kullanılacaktır.
3. 24 oyuklu Plakaları aşılayın:
  1. Her tedaviyi kendi plakasında üç sıra biyolojik kopya ve bir sıra steril kontrol ile test edin (Şekil 1).
  2. 14 ml'lik ana karışımı kullanarak, steril 24 oyuklu bir plakanın altı kuyucuğunun her birine 2 ml ekleyin. Üç biyolojik kopya ve steril kontrol için tamamlayın (Şekil 1). Her tedavi için tekrarlayın.
  3. Plakaları parafin film ile kapatın ve 30 °C'de 7 gün boyunca statik olarak inkübe edin.
  4. Hasat ve pelikül kuru ağırlığını ölçün (Selüloz Verimi) (Şekil 1):
    1. Pelikülleri tek tek 6 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Hücreleri parçalamak için, pelikülleri 20 dakika boyunca 80 ° C'de 12 ml 0.1 N sodyum hidroksit (NaOH) ile tedavi edin.
    2. NaOH'yi çıkarın ve ultra saf su ile 24 saat çalkalayarak yıkayarak pelikülleri nötralize edin. Suyu her 6 saatte bir değiştirin.
      NOT: Yıkama aşaması tamamlandıktan sonra peliküller beyaz olmalıdır.
    3. Pelikül ağırlıklarını silikon paspasların üzerine yerleştirin ve 50 °C'de 48 saat sabit ağırlığa kadar kurutun. Kuruduktan sonra bunları paspaslardan çıkarın ve bakteriyel selüloz verimini belirlemek için ağırlıklarını analitik bir ölçekte ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1: Pelikül tahlili ve analizi için kullanılan protokolü gösteren akış şeması. Stok CEPA takviyeli pH 7 SH ortamı (60 ml), üç ayrı biyolojik kopya aşılama ve bir steril kontrol (her biri 14 ml) için alikotasyona tabi tutulur. Bu kültürler daha sonra 24 oyuklu bir pla...