Bir Bakteriyel Konakçıda İntihar Plazmidinin Amplifikasyonu

Özet

Kaynak: Tomás, J. M. ve diğerleri. Bakteriyel Glikosiltransferazların Bakteriyel Hareketlilikteki Rolünü Aydınlatmak için Boş Mutantların Üretimi. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, E. coli'de bir intihar plazmitinin başlatıcıya bağlı amplifikasyonunu göstermektedir.Bir antibiyotik direnç geni taşıyan plazmit, yalnızca konakçı tarafından kodlanan bir başlatıcı proteinin varlığında çoğalır. Elektroporasyon ve geri kazanım ortamında inkübasyondan sonra, karışım antibiyotik içeren agar üzerine kaplanır. Başlatıcı proteini, plazmidin antibiyotiğe dirençli geninin ekspresyonuna izin verdiği için plazmitli bakteriler hayatta kalır.

Protokol

1. Flagella glikosilasyon adası genlerinde boş mutantların üretilmesi

NOT: Bu mutajenez yöntemi, intihar vektörü pDM428 (GenBank: KC795686.1) kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) çerçeve içi silme ürünlerinin alelik değişimine dayanmaktadır. pDM4 vektörünün replikasyonu lambda pir'e bağlıdır ve tam alelik değişim, vektör üzerinde bulunan sacB geni kullanılarak zorlanır.

1. PCR çerçeve içi silme ürünlerinin yapımı.
   1. Silinecek seçilen gen veya bölgenin yukarı akıştaki (A ve B primerleri) ve aşağı akıştaki (C ve D primerleri) DNA bölgelerini çoğaltan iki çift primer tasarlayın (Şekil 1B).
   2. Primer A ve D'nin, silinecek gen veya genlerin sırasıyla başlangıçtan itibaren yukarı ve aşağı akışından 600 bp'den fazla olduğundan emin olun. Bu iki primerin, pDM4'te klonlamaya izin veren bir endonükleaz için 5' ucunda bir kısıtlama bölgesi içermesi gerekir.
      NOT: A ve D primerlerinin 5' ucunda yer alan kısıtlama bölgesi, AB veya CD amplikonları içindeki bölgelerle aynı olmamalıdır.
   3. Primer B ve C'nin silinecek gen içinde veya silinecek bölgenin sırasıyla ilk ve son geninin içinde olduğundan emin olun. Her iki primerin (B ve C) çerçeve içinde olduğundan ve genin içinde 5-6 kodon arasında yer aldığından emin olun. Ayrıca, her iki primerin de 5' ucunda DNA amplikonları AB ve CD'nin birleştirilmesine izin veren 21 bp'lik bir tamamlayıcı dizi (Tablo 1) içerdiğinden emin olun.
   4. Seçilen Aeromonas suşunu gece boyunca 30 °C'de (O/N) 5 mL triptik soya suyu (TSB) içinde büyütün. Genomik DNA saflaştırması için piyasada bulunan bir kit kullanın ve üreticinin talimatlarını izleyin (Malzeme Tablosu). Bir spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış DNA'nın 2 μL'sini ölçün.
      NOT: Alet 260 nm'de absorbansı kaydedecek şekilde ayarlanmış haldeyken, boş olarak çift damıtılmış su kullanın. 2 μL saflaştırılmış DNA ile absorbansı 3-5 kez kaydedin ve ortalama bir absorbans okuması hesaplayın. DNA konsantrasyonunu hesaplamak için Beer-Lambert yasasını kullanın, burada A = Ɛ.c.l. Burada "A" absorbanstır, "Ɛ" DNA için molar ortalama yok olma katsayısıdır, "c" DNA konsantrasyonudur ve "l" yol uzunluğudur (her bir aletin yol uzunluğu için üreticinin talimatlarına bakın).
   5. AB ve CD primerleri ile iki asimetrik PCR setinde şablon olarak 100 ng saflaştırılmış kromozomal DNA kullanın (Malzeme Tablosu). A:B ve D:C primer çiftlerinin 10:1 molar oranını kullanın.
      NOT: Asimetrik PCR'ler, şablonun bir zincirinin diğerine göre tercihli amplifikasyonuna izin verir.
   6. PCR ürünlerini %1'lik bir agaroz jel içinde elektroforez ile analiz edin. Jel çalışma tamponu olarak TAE (40 mM Tris-asetat, 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA)) ve 8 V/cm'lik bir güç ayarı kullanın. DNA'yı görselleştirmek için jele etidyum bromür (0,5 μg/mL) ekleyin ve PCR ürünlerini bir biyo-görüntüleme istasyonu kullanarak görselleştirin (Malzeme Tablosu).
   7. Amplikonları bir neşter kullanarak jelden çıkarın, üreticinin protokolünü (Malzeme Tablosu) izleyerek saflaştırın ve miktarını belirleyin.
   8. AB ve CD amplikonlarını, PCR ürünlerinin 3' ucundaki 21 bp'lik örtüşen dizileriyle birleştirin (Şekil 2). Her amplikonun (AB ve CD) 100 ng'sini PCR reaktifleri (AD öncesi PCR) içeren, ancak primerler içermeyen bir PCR tüpünde karıştırın ve termocycler programını kullanarak uzatın. Daha sonra reaksiyona (AD PCR) 100 μM A ve D primeri ekleyin ve tek bir parça olarak çoğaltın.
   9. PCR ürününü (AD amplikonu), adım 1.1.6'da açıklanan koşulları kullanarak %1'lik bir agaroz jel içinde elektroforez yoluyla analiz edin, amplikonu jelden çıkarın, üreticinin protokolünü izleyerek saflaştırın ve amplikonun miktarını belirleyin (Malzeme Tablosu).
2. Çerçeve içi silme ile pDM4 rekombinant plazmitinin oluşturulması.
   1. 30 °C'de kloramfenikol (25 μg/mL) ile Luria-Bertani (LB) Miller suyunda (10 mL) pDM4 içeren Escherichia coli cc18λ pir'in bir O/N kültürünü büyütün.
   2. Kültürü 4 ° C'de 5.000 x g'da döndürün ve peleti 600 μL steril damıtılmış suda süspanse edin. Sağlayıcının talimatlarını izleyerek, piyasada bulunan bir plazmit saflaştırma kiti kullanarak plazmit pDM4'ün ekstraksiyonunu ve saflaştırılmasını gerçekleştirin (Malzeme Tablosu).
   3. AD amplikonunun her iki ucunu ve pDM4'ün klonlama bölgesini sindirebilen bir endonükleaz ile 1 μg pDM4 ve 400 ng AD amplikonunu 2 saat boyunca sindirin (Şekil 2). Reaksiyon koşulları için enzim üreticisinin protokolünü izleyin (Malzeme Tablosu).
   4. Sindirilmiş plazmidi ve amplikonu bir DNA saflaştırma kiti kullanarak temizleyin ve üreticinin talimatlarını izleyerek bunları ölçün (Malzeme Tablosu).
   5. Doğrusallaştırılmış pDM4'ün bağlanmasını önlemek için, üreticinin talimatlarını izleyerek alkalin fosfataz enzimini kullanarak fosfat grubunu her iki 5' ucundan çıkarın (Malzeme Tablosu). Ardından, işlenmiş plazmidi temizleyin ve adım 1.1.4'te (Malzeme Tablosu) açıklandığı gibi bir spektrofotometre kullanarak miktarını belirleyin.
   6. 150 ng sindirilmiş ve fosfataz alkali ile muamele edilmiş pDM4'ü 95-100 ng sindirilmiş AD amplikonu ile 1:4 molar vektör:insert oranında birleştirin. Ligasyon reaksiyonunu üreticinin talimatlarını izleyerek 15 μL'lik bir hacimde hazırlayın (Malzeme Tablosu).
   7. O/N'yi 20 °C'de veya hafta sonu 4 °C'de inkübe edin. İnkübasyondan sonra, T4 ligazını 70 °C'de 20 dakika boyunca inaktive edin.
   8. Plazmidi elektroporasyon yoluyla Escherichia coli MC1061λpir suşuna sokmak için ligasyon kullanın. Elektrokompetan bakteriler ve 2 mm aralıklı elektroporasyon küvetleri kullanın.
3. Elektrokompetan E. coli'nin hazırlanması ve pDM4 rekombinant plazmidinin elektroporasyonu
   1. Tek bir E. coli MC1061λpir suşu kolonisini Luria-Bertani (LB) Miller suyuna aşılayın ve 200 rpm çalkalama ile 30 °C'de O/N büyütün.
   2. 2 mL bakteri kültürünü 18 mL LB suyu içinde seyreltin ve 0.4-0.6 arasında bir optik yoğunluk (OD600) elde edilene kadar çalkalayarak (200 rpm) 30 °C'de inkübe edin.
   3. Bakteri kültürünü 5.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı atın ve peleti 40 mL soğutulmuş damıtılmış H₂O içinde süspanse edin.
   4. Tüm kültür tuzlarını çıkarmak için bu temizleme adımını iki kez daha tekrarlayın. Son olarak, peleti 4 mL soğutulmuş damıtılmış H₂O içinde süspanse edin ve 1 mL süspansiyonu dört konik 1.5 mL mikrofüj tüpünün her birine aktarın.
   5. Bakteri kültürünü 14.000 x g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüjleme ile pelet haline getirin. Peleti bozmadan süpernatanı çıkarın ve her peleti 100 μL soğutulmuş damıtılmış H₂O içinde süspanse edin.
   6. Her tüpe 3-3.5 μL ligasyon karışımı ekleyin ve buz üzerinde 5 dakika inkübe edin. Ardından, her tüpün içeriğini soğutulmuş 2 mm boşluklu bir elektroporasyon küvetine aktarın ve 2 kV, 129 Ω ve yaklaşık 5 ms'lik bir zaman sabiti uygulayın.
      NOT: Elektroporasyon küvetlerini buz üzerinde önceden soğutun. Tüm prosedür boyunca bakterileri buz üzerinde tutun.
   7. Elektroporasyondan sonra, içeriklerini geri kazanmak için dört küvetin her birine 250 μL SOC (Katabolit baskılamalı Süper Optimal et suyu) ortamı ekleyin, bunları bir kültür tüpüne (yaklaşık 1 mL) aktarın ve çalkalayarak (200 rpm) 30 °C'de 1 saat inkübe edin.
   8. Plaka üzerinde büyüyen tüm kolonilerin plazmit omurgasına sahip olmasını sağlamak için dönüştürülmüş hücreleri kloramfenikol (25 μg/mL) ile desteklenmiş Luria-Bertani (LB) agar plakalarına yerleştirin.

Tablo 1: Boş mutantların yapımında kullanılan primerler. B ve C primerlerinde örtüşen bölgelerin altı çizilir. BamHI sitesi, A ve D primerlerinde kalın harflerle yazılmıştır.

Astar adı	5' ila 3' yönünde sıralama	İçin kullanılır
A. piscicola AH-3
A-Flgi1	CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA	FGI mutant
B-FLGI1	CCCATCCACTAAACTTAAACAGATCACCTCGAACTCGAAA
C-Flgi12	TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGGAACCTTAAATGCCATGA
D-FLGI12	CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC
E-Flgi1	ACCCGCTTCATTCGCTAT
F-Flgi12	TCCGATTTTCTGACTCAGGG
A-FGI4	CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA	FGI-4 Mutantı
B-FGI4	CCCATCCACTAAACTTAAACACATATTATCTTGCCCCTGAT
C-FGI4	TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGATGGAGCTAATCACTCGTTT
D-FGI4	CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC
E-FGI4	ATTTCCCTGCCAAATACG
F-Fgi4	CCTGCCAACAGGATGTAAG
pDM4 vektörü
pDM4 için	AGTGATCTTCCGTCACAGG	pDM4 vektörüne eklemeler
pDM4rev	AAGGTTTAACGG ÇOK ŞTTİ

Sonuçlar

Şekil 1: Kromozomal bölgelerin biyoinformatik tespiti ve primer tasarımı. (A) A. hydrophila AH-1 ve A. piscicola AH-3'te tanımlanan kromozomal bölgelerin şeması. A. hydrophila AH-1 flagella glikosilasyon adası, flagella glikanı sadece bir ps...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ABI PRISM Büyük Boya Terminatör v. 3.1 Döngü Sıralama Hazır Reaksiyon Kiti	Uygulamalı Biyosistemler	4337455	Sıralama için kullanılır
AccuPrime Taq DNA Polimeraz, yüksek doğruluk	Davetli	12346-086	AB, CD ve AD fragmanlarının amplifikasyonu için kullanılır
Agaroz	Conda-Pronadise	8008	DNA elektroforezi için kullanılır
Alkalen fosfataz, buzağı bağırsağı (CIAP)	Promega	M1821 Serisi	5' ucundaki fosfatı çıkarmak için kullanılır
Bacto agar	Becton Dickinson	214010	Hareketlilik analizi için kullanın
BamHI	Promega	R6021 Serisi	Endonükleaz kısıtlaması için kullanılır
BglII	Promega	R6081 Serisi	Endonükleaz kısıtlaması için kullanılır
BioDoc-It Hayal Sistemi	UVP'nin		DNA görselleştirme için kullanılan biyo-görüntüleme istasyonu
Biyotaq polimeraz	Biyolin	BIO-21040 (İngilizce)	Koloni taraması için kullanılır
Cytiva illustra GFX PCR DNA ve Jel Bant Arıtma Kiti	Cytivia	28-9034-71	PCR amplikonlarının ve DNA fragmanlarının saflaştırılması için kullanılır.
EDTA	Uygulama	131026.1211	DNA elektroforezi için kullanılır
Elektroporasyon küvetleri 2 mm boşluk	VWR	732-1133	Dönüşüm için kullanılır
Luria-Bertani (LB) Miller agar	Condalab	996	Escherichia coli kültürü için kullanılır
Luria-Bertani (LB) Değirmenci suyu	Condalab	1551	Escherichia coli kültürü için kullanılır
Nano damla ND-1000	NanoDrop Teknoloji A.Ş.		DNA miktar tayini için kullanılan spektrofotometre
Rifampisin	Uygulama	A2220,0005	Üç ebeveynli çiftleşme için kullanılır
SOC Ortamı	Davetli	15544034	Elektroporasyon geri kazanımı için kullanılır
T4 DNA ligaz	Davetli	15224017	Ligasyon reaksiyonu için kullanılır
Veriti 96 kuyulu Termal Döngüleyici	Uygulamalı Biyosistemler		PCR reaksiyonları için kullanılır