Bu video, E. coli'de bir intihar plazmitinin başlatıcıya bağlı amplifikasyonunu göstermektedir.Bir antibiyotik direnç geni taşıyan plazmit, yalnızca konakçı tarafından kodlanan bir başlatıcı proteinin varlığında çoğalır. Elektroporasyon ve geri kazanım ortamında inkübasyondan sonra, karışım antibiyotik içeren agar üzerine kaplanır. Başlatıcı proteini, plazmidin antibiyotiğe dirençli geninin ekspresyonuna izin verdiği için plazmitli bakteriler hayatta kalır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir Bakteriyel Konakçıda İntihar Plazmidinin Amplifikasyonu
754 görüntülenme
⸱
26 Eylül 2025
Bu makalede
Özet
Protokol
1. Flagella glikosilasyon adası genlerinde boş mutantların üretilmesi
NOT: Bu mutajenez yöntemi, intihar vektörü pDM428 (GenBank: KC795686.1) kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) çerçeve içi silme ürünlerinin alelik değişimine dayanmaktadır. pDM4 vektörünün replikasyonu lambda pir'e bağlıdır ve tam alelik değişim, vektör üzerinde bulunan sacB geni kullanılarak zorlanır.
- PCR çerçeve içi silme ürünlerinin yapımı.
- Silinecek seçilen gen veya bölgenin yukarı akıştaki (A ve B primerleri) ve aşağı akıştaki (C ve D primerleri) DNA bölgelerini çoğaltan iki çift primer tasarlayın (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1: Kromozomal bölgelerin biyoinformatik tespiti ve primer tasarımı. (A) A. hydrophila AH-1 ve A. piscicola AH-3'te tanımlanan kromozomal bölgelerin şeması. A. hydrophila AH-1 flagella glikosilasyon adası, flagella glikanı sadece bir ps.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| ABI PRISM Büyük Boya Terminatör v. 3.1 Döngü Sıralama Hazır Reaksiyon Kiti | Uygulamalı Biyosistemler | 4337455 | Sıralama için kullanılır |
| AccuPrime Taq DNA Polimeraz, yüksek doğruluk | Davetli | 12346-086 | AB, CD ve AD fragmanlarının amplifikasyonu için kullanılır |
| Agaroz | Conda-Pronadise | 8008 | DNA elektroforezi için kullanılır |
| Alkalen fosfataz, buzağı bağırsağı (CIAP) | Promega | M1821 Serisi | 5' ucundaki fosfatı çıkarmak için kullanılır |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Hareketlilik analizi için kullanın |
| BamHI | Promega | R6021 Serisi | Endonükleaz kısıtlaması için kullanılır |
| BglII | Promega | R6081 Serisi | Endonükleaz kısıtlaması için kullanılır |
| BioDoc-It Hayal Sistemi | UVP'nin | DNA görselleştirme için kullanılan biyo-görüntüleme istasyonu | |
| Biyotaq polimeraz | Biyolin | BIO-21040 (İngilizce) | Koloni taraması için kullanılır |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA ve Jel Bant Arıtma Kiti | Cytivia | 28-9034-71 | PCR amplikonlarının ve DNA fragmanlarının saflaştırılması için kullanılır. |
| EDTA | Uygulama | 131026.1211 | DNA elektroforezi için kullanılır |
| Elektroporasyon küvetleri 2 mm boşluk | VWR | 732-1133 | Dönüşüm için kullanılır |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Escherichia coli kültürü için kullanılır |
| Luria-Bertani (LB) Değirmenci suyu | Condalab | 1551 | Escherichia coli kültürü için kullanılır |
| Nano damla ND-1000 | NanoDrop Teknoloji A.Ş. | DNA miktar tayini için kullanılan spektrofotometre | |
| Rifampisin | Uygulama | A2220,0005 | Üç ebeveynli çiftleşme için kullanılır |
| SOC Ortamı | Davetli | 15544034 | Elektroporasyon geri kazanımı için kullanılır |
| T4 DNA ligaz | Davetli | 15224017 | Ligasyon reaksiyonu için kullanılır |
| Veriti 96 kuyulu Termal Döngüleyici | Uygulamalı Biyosistemler | PCR reaksiyonları için kullanılır |
