Gram-Negatif Bakterilerin Genomik Transpozon Eklemeleri ile İzolasyonu

Bu makalede

Özet

Kaynak: Kazi, M.I., vd. al., Yüksek Verimli Dizileme için Gram-Negatif Bakterilerde Transpozon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, kanamisin direncine dayalı olarak transpozon eklemeleri taşıyan Gram-negatif alıcı bakterilerin seçimini, miktarını ve korunmasını göstermektedir.

Protokol

Nihai bakteriyel mutant kitaplığının oluşturulması

Donmuş çiftleşmenin bir kısmını buz üzerinde çözün.
Adım 3.1'de hesaplanan koloni oluşturan birimlere (CFU) dayalı olarak kanamisin ile desteklenmiş 150 mm Luria-Bertani (LB) agar plakaları üzerinde plaka eşleşmesi. Kaplamadan önce 150 μL başına 13.333 koloni elde etmek için hacmi LB ile ayarlayın.
NOT: Buradaki CFU sayısı yaklaşık 10⁵ CFU/mL olarak belirlendi, bu nedenle çiftleşme hacmi plaka başına 13.333 koloni elde edecek şekilde ayarlandı. Bu, plakaları aşırı kalabalıklaştırmadan yüksek çözünürlüklü bir mutant kütüphane için 30 plaka üzerinde optimal sayıda koloni sağlayacaktır.
400.000 koloni elde etmek için kanamisin ile desteklenmiş 30 x 150 mm Luria-Bertani agar plakalarına plaka başına 150 μL seyreltme yaymak için steril cam boncuklar kullanın (Şekil 1C).
NOT: Bakterileri plakalara yaymak için steril çubuklar veya herhangi bir steril yayıcı alet (yani cam boncuklar) kullanılabilir.
Fazla eşleşme içeren kullanılmış tüpü atın.
NOT: Donma/çözülme döngüleri, bakteri kültürü üzerinde seçici baskılar ekler ve bu da Tn-seq deney sonuçlarını çarpıtabilir. Her seferinde yeni bir alikot kullanın.
Plakaları 37 °C'de 14 saat inkübe edin.
NOT: Kuluçka süresi, aşırı büyümeyi (kolonilerin birbirine değmesini) önlemek için optimize edilmiştir. Kuluçka süresini kısaltarak büyümenin en aza indirilmesi önerilmektedir.

Kitaplık yoğunluğunu tahmin etme ve depolama için havuzlama

Transpozon kitaplığındaki toplam mutantları tahmin etmek için her plakadaki CFU'ları sayın. Tüm plaka grubu için koloni sayısı tahminini belirlemek için en az 3 plakanın %20'sini sayın (Şekil 2A). Kolonilerin başka bir koloniye temas etmediğinden emin olun.
Tahmini koloni verimini hesapladıktan sonra, her plakaya 3-5 mL LB (veya gerekirse daha fazla) ekleyin ve steril bir kazıma aleti kullanarak bakterileri kazıyın. NOT: Plakaları verimli bir şekilde kazımak için steril aşılama halkaları kullanıldı.
Tüm plakalardan bakteri süspansiyonlarını 50 mL'lik konik tüplere toplayın (Şekil 1D). Bu, en az 3 olmak üzere birden fazla 50 mL'lik konik tüp gerektirecektir.
Pelet havuzlanmış bakteri süspansiyonu, 7 dakika boyunca 5.000 x g'da santrifüjleme kullanılarak toplanmıştır.
Süpernatanı atın ve peleti% 30 gliserol ile desteklenmiş 5 mL LB içinde yeniden süspanse edin.
Transpozon kitaplığının 1 mL'sini dondurarak saklama şişelerine ayırın ve -80 °C'de saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1: Transpozon mutant kütüphane yapısının şeması. (A) Bakteriyel konjugasyon. Transpozisyon mekanizmasını kodlayan "donör" suş, "alıcı" suş ile karıştırıldı. Karışım, Luria-Bertani (LB) agar plakalarında tespit edildi ve 1 saat boyunca çif...