Staphylococcus aureus'ta Yetkinliğe Bağlı DNA Alımı

Özet

Kaynak: Cafini, F., et.al. Staphylococcus aureus'ta Yatay Gen Transferinin İncelenmesi için Metodoloji. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, doğal dönüşüm yoluyla Staphylococcus aureus'ta yetkinlik kaynaklı DNA alımını göstermektedir. Bir sigma faktörünü yapısal olarak eksprese etmek üzere tasarlanmış kloramfenikol'e duyarlı bir suş, yeterliliği arttırmak için besin sınırlayıcı koşullar altında kültürlenir, daha sonra bir direnç geni taşıyan donör DNA'sı ile inkübe edilir. Başarılı gen transferi, kloramfenikol dirençli transformantların seçici büyümesi ile doğrulanır.

Protokol

1. Doğal Dönüşüm

NOT: Alıcı olarak N315 türevi N2-2.1 kullanıldı. Bu suşta, sigH lokusu, SigH'yi yapısal olarak ifade edecek şekilde çoğaltıldı. Transfer edilecek direnç belirteci kloramfenikol değilse, SigH'yi ifade etmek için pRIT-sigH (Cm^R) kullanılabilir. CFR ile elde edilen S. aureus COL-45'ten saflaştırılmış plazmit veya tam DNA özütü, transformasyon için donör DNA olarak kullanılır.

1. Donör DNA'sının hazırlanması
   1. COL-45'i, 32 mg/L kloramfenikol ile desteklenmiş 50 mL Triptik soya suyu (TSB) içeren 300 ml'lik bir şişede 37 °C'de çalkalayarak gece boyunca yetiştirin. Kontrol deneyi için plazmidi çıkarmak için pHY300 plazmidi ^(TetR) taşıyan kültür E. coli HST04.
      NOT: HST04 (baraj^-/dcm^-), DNA metilaz genlerinden yoksundur. DNA metilazlı diğer geleneksel suşlar da DNA donörünü hazırlamak için kullanılabilir, çünkü DNA metilasyon durumu transformasyon verimliliğini etkilemez. Alternatif olarak, S. aureus COL suşundan saflaştırılan pT181 plazmidi, dönüşüm testi için pozitif bir kontrol olarak da kullanılabilir.
   2. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın (4 °C'de 10 dakika boyunca 8.000 x g ).
   3. Tüm DNA'yı saflaştırmak için bir plazmit DNA ekstraksiyon kiti veya geleneksel bir DNA saflaştırma yöntemi kullanarak plazmitleri ekstrakte edin.
   4. Saflaştırılmış DNA'yı spektrometre ile ölçün ve kullanana kadar 4 °C'de tutun.
      NOT: Dönüşüm testi için genellikle bir haftadan daha eski olan yeni bir DNA preparatı kullanın. Eski DNA preparatları dönüşümün etkinliğini azaltır.
2. Dönüşüm testi
   1. Alıcı hücreyi (N2-2.1) gece boyunca 5 ml TSB içinde 37 ° C'de çalkalayarak kültürleyin.
   2. 0.5 ml gece kültürünü 1.5 ml'lik bir tüpe aktarın. Hücreleri santrifüjleme ile çökeltin (4 °C'de 1 dakika boyunca 10.000 x g ).
   3. Hücreleri 50 ml'lik bir tüpte 10 mL CS2 ortamı ile süspanse edin.
      NOT: CS2 besiyeri, S. aureus'ta doğal dönüşüm için yetkinlik sağlayan tam bir sentetik besiyeridir. TSB veya Beyin kalp infüzyonu (BHI) gibi diğer standart laboratuvar ortamları dönüşüm için uygun değildir.
   4. Bakterileri 37 °C'de çalkalayarak (180 rpm) geç üstel faza (yaklaşık 8 saat) kadar büyütün.
   5. Hücreleri santrifüjleme ile hasat edin (4 °C'de 5 dakika boyunca 5.000 x g ).
   6. Hücreleri 10 ml taze CS2 ortamında yeniden süspanse edin.
   7. Hücre süspansiyonuna 10 μg saflaştırılmış plazmit veya genom DNA'sı (adım 1.1.4) ekleyin. 37 °C'de ve 180 rpm'de 2,5 saat çalkalayın.
      NOT: DNA ile daha kısa inkübasyon süreleri (<2,5 saat) daha düşük transformasyon frekanslarına neden olur.
   8. Santrifüjleme ile hücreleri toplayın (4 °C'de 5 dakika boyunca 5.000 x g ).
   9. Hücreleri 10 mL BHI ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 90 ml eritilmiş BHI agar (55 °C) takviyesi ile 32 mg/L kloramfenikol (veya kontrol deneyinde 5 mg/L tetrasiklin) ile karıştırın. Karışımı 90 mm'lik Petri kaplarına dökün. Hızla soğutun ve agarın katılaşmasına izin verin.
   10. Plakaları 37 °C'de 2 gün inkübe edin.
   11. Direnç özelliklerini doğrulamak için kolonileri (kürdan kullanarak) uygun antibiyotikleri içeren yeni BHI agar plakalarına aktararak oluşturulan kolonileri (dönüştürücüler) çoğaltın. Edinilmiş direnç genini (cfr veya tetM) koloni PCR ile doğrulayın.

Malzemeler