C. elegans Knockdown'ların Taranması için Çok Kuyulu Sıvı Bazlı Bir Test

Özet

Kaynak: Anderson, Q. L. ve diğerleri. Yüksek verimli, Yüksek içerikli, Sıvı bazlı bir C. elegans Patosystem. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, konakçı-patojen etkileşimleri sırasında gen yıkımlarını incelemek için Caenorhabditis elegans kullanan yüksek verimli bir tarama yöntemini göstermektedir. Patojen kaynaklı solucan öldürmenin etkilerini değerlendirmek için devrilme solucanlarının hazırlanması ve bunların tahlil plakalarına aktarılması prosedürünü özetlemektedir.

Protokol

1. Çoklu Caenorhabditis elegans Suşlarının veya Yıkımlarının Taranması için Uyarlama (Ribonükleik Asit Girişimi (RNAi) Tarama Kurulumu)

Not: Bu, 24 oyuklu bir plaka kurulumu için açıklanan bir RNAi ekranıdır.

1. RNAi ile tohumlanmış solucanlar içeren 24 oyuklu bir plakanın kuyucuğu başına 1 mL S Bazal ekleyin. Plakayı sallayarak solucanları hafifçe çalkalayın, ardından solucanları boş, steril 24 derin kuyulu bir plakaya aktarın. Solucanların yerçekimsel olarak yerleşmesine izin verin (~5 dakika).
2. Süpernatanı aspire edin, yaklaşık 1 mL bırakın. Her kuyucuğa 7 mL S Bazal ekleyin.
3. 1.1 - 1.2 arasındaki adımları en az 2 kez daha tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, yaklaşık 400 μL bırakarak süpernatanı aspire edin.
4. Solucan sıralayıcının Yeniden Örnekleyici işlevini kullanarak, 24 oyuklu plaka solucan süspansiyonundan 22 solucanı 384 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna sıralayın (24 oyuklu bir plakanın her bir kuyusu, 384 oyuklu bir plakanın 8 - 12 kuyusunu verir).
   1. Açlığı önlemek için, ayırmadan önce bakterileri 384 oyuklu plakalara (OP50 gibi yalnızca gıda görevi gören bir suş veya patojenik bir suş) pipetleyin.
5. Solucanlar 384 oyuklu plakaya ayrıldıktan sonra, küçük moleküller veya deneye özel diğer malzemeleri ekleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
COPAS FP BiyoSıralayıcı	Birlik Biometrica		Büyük nesne akış sitometresi/solucan ayırıcı
24 Derin Kuyu RB Bloğu	Thermo Fisher Bilimsel	CS15124
384 Kuyulu plaka	Greiner Biyo-Bir	MPG-781091
Nematod Büyüme Ortamı (NGM)			Litre başına miktar: 18 gram agar, 3 gram NaCl, 2.5 gram Pepton, 1 mL Kalsiyum klorür (1 M), 1 mL Magnezyum sülfat (1 M), 25 mL Fosfat tamponu ve 973 mL mili-Q su
S Bazal			Litre başına miktar: 5.85 gram NaCl, 6 gram Monobazik potasyum fosfat, 1 gram Dibazik potasyum fosfat ve 1 Litre mili-Q su
Agar	USBiyolojik Yaşam Bilimleri	A0930 Serisi
NaCl	USBiyolojik Yaşam Bilimleri	S5000 Serisi
Pepton	USBiyolojik Yaşam Bilimleri	P3300 Serisi
Kalsiyum klorür	USBiyolojik Yaşam Bilimleri
Magnezyum sülfat	Fisher Bilimsel	M63-500 Serisi
Fosfat tamponu			Litre başına miktar: 132 mL Dibazik potasyum fosfat (1M) ve 868 mL Monobazik potasyum fosfat (1M)
Monobazik potasyum fosfat	Acros Organik	7778-77-0
Dibazik potasyum fosfat	USBiyolojik Yaşam Bilimleri	P5100 Serisi
Bakteriyel Suşlar
P. aeruginosa (PA14)
E. coli süper gıda (OP50)
E. coli RNAi eksprese eden bakteriler (HT115)
Solucan Suşu
glp-4(bn2) (Beanan ve Strome, 1992, PMID: 1289064)