C. elegans Larvalarında Patojenik Bakteri Kaynaklı Mortalitenin Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Anderson, Q. L., ve diğerleri. Yüksek verimli, Yüksek içerikli, Sıvı bazlı bir C. elegans Patosystem. J. Vis. Uzm. (2018)

Video, genetiği değiştirilmiş C. elegans larvalarının bir mikroplakada patojenik bakterilere maruz bırakıldığı sıvı bazlı bir testi göstermektedir. Ortama salgılanan bakteriyel toksinler, konakçı stresine ve ölümüne neden olur. Bir floresan boya, ölü solucanları boyayarak, genetik duyarlılığı veya direnci değerlendirmek için görüntülemeye dayalı ölüm oranının ölçülmesine izin verir.

Protokol

1. Sıvı Öldürme Testi Kurulumu (Temel Protokol)

Not: Bu, bir bakteri türü ve bir solucan kaynağı için bir protokoldür.

1. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, Pseudomonas aeruginosa'yı bir Yavaş Öldürme veya SK plakasından çıkarın ve ~ 5 mL S Bazal'da yeniden süspanse edin. Gerekirse ölçeği büyütün. Bir spektrofotometre (OD₆₀₀) kullanarak bakteri süspansiyonunun optik yoğunluğunu ölçün
2. OD_{600 ≈} 0.09'da (3X nihai konsantrasyon) S Bazal'da 24 mL seyreltilmiş P. aeruginosa stoğu hazırlayın. Kuyucuk başına nihai içerik için 4.6.2'ye bakın ve bakteriyel seyreltme hacmini buna göre ölçeklendirin.
3. 1 mM'lik nihai konsantrasyona 21 mL sıvı Slow Kill ortamı (3 g NaCl, CaCl₂ ve MgSO₄ ile desteklenmiş 3.5 g pepton/L) ekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 384 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 45 μL bakteri ve ortam aktarın.
4. Solucanları kaynaklarından 50 mL'lik konik bir tüpe yıkayın ve solucanların yerçekimi kuvveti altında yerleşmesine izin verin. Süpernatanı 5 mL'ye aspire edin. Toplam 50 mL S bazalda yeniden süspanse edin.
5. Adım 1.4'ü iki kez tekrarlayın.
6. Bir solucan sıralayıcı kullanarak, 384 oyuklu plakanın her bir kuyucuğuna yaklaşık 22 solucanı ayırın.
   Not: Kurulum, her bir solucanı ~1.1 μL sıvıya düşürür. 22 solucan 25 μL'ye ulaşacak ve toplam tahlil hacmini 70 μL/kuyuya getirecektir.
   1. Her bir kuyucuğun nihai bileşimi 70 μL'den oluşur. Bu hacmin 45 μL'si bakteri ortamı olarak eklenir (24 μL S Bazal'da 0.03 OD₆₀₀ bakteri ve CaCl₂ ve MgSO₄ ile desteklenmiş 21 μL SK). Diğer 25 μL, 22 solucan ile eklenir.
   2. Burada kullanılan ayırıcı ( Malzeme Tablosuna bakınız) mevcut değilse, solucanlar S Bazal'da 1 solucan/μL'lik nihai konsantrasyona seyreltilebilir ve çok kanallı bir pipet kullanılarak 25 μL/kuyu pipetlenebilir. Bununla birlikte, sonuçlar artan değişkenlik gösterebilir. Alternatif olarak, Leung ve meslektaşları tarafından açıklandığı gibi peristaltik bir sıvı dağıtıcı kullanmak mümkündür.
7. Solucanlar 384 oyuklu plakaya ayrıldıktan sonra, plakayı gaz geçirgen bir filmle kapatın ve plakaları 25 °C'de 24 - 48 saat inkübe edin.
8. İstenilen zamanda, 384 oyuklu plakayı S Basal ile toplam 5 kez yıkamak için bir mikroplaka yıkayıcı kullanın.
   1. İkinci yıkamadan sonra, ~20 μL bırakarak ortamın çoğunu aspire edin. Kuyucukların dibindeki kalıntıları gevşetmek için bir mikroplaka vorteksleyici kullanarak plakaları en az 30 saniye kuvvetlice sallayın).
9. Son yıkamadan sonra, süpernatanı 20 μL'ye kadar aspire edin. 0,7 μM'lik bir nihai konsantrasyon için 384 oyuklu plakanın 50 μL 0,98 μM nükleik asit lekesini ( Malzeme Tablosuna bakınız)/kuyusunu ekleyin.
10. Oda sıcaklığında 12-16 saat inkübe edin. Bu boya sadece ölü solucanları lekeleyecektir. İstenilen inkübasyon süresinden sonra, fazla lekeyi çıkarmak için plakaları mikroplaka yıkayıcı kullanarak yıkayın (en az 3 yıkama).
11. Veri toplama için, hem iletilen ışığı hem de floresansı (531 nm uyarma ve 593 nm emisyon) görüntülemek için bir spektrofotometre veya otomatik mikroskop kullanın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
COPAS FP BiyoSıralayıcı	Birlik Biometrica		Büyük nesne akış sitometresi/solucan ayırıcı
Sitasyon 5	BioTek
EL406 Yıkayıcı Dispenseri	BioTek
Multitron Pro	Bilgi HT
24 Derin Kuyu RB Bloğu	Thermo Fisher Bilimsel	CS15124
384 Kuyulu plaka	Greiner Biyo-Bir	MPG-781091
Nematod Büyüme Ortamı (NGM)			Litre başına miktar: 18 gram agar, 3 gram NaCl, 2,5 gram Pepton, 1 mL CaCl₂ (1 M), 1 mL MgSO₄ (1 M), 25 mL Fosfat tamponu ve 973 mL mili-Q su
Yavaş Öldürme (SK) plakaları			Litre başına miktar: 18 gram agar, 3 gram NaCl, 3.5 gram Pepton, 1 mL CaCl₂ (1 M), 1 mL MgSO₄ (1 M), 25 mL Fosfat tamponu ve 973 mL mili-Q su
Yavaş Öldürme (SK) medyası			Litre başına miktar: 3 gram NaCl, 3,5 gram Pepton, 1 mL CaCl₂ (1 M), 1 mL MgSO₄ (1 M), 25 mL Fosfat tamponu ve 973 mL mili-Q su
Lizojeni Suyu (LB)	USBiyolojik Yaşam Bilimleri	L1520 Serisi
Brian Kalp İnfüzyon suyu (BHI)	Araştırma Ürünleri Uluslararası A.Ş.	50-488-526
Solucan Ağartıcı Solüsyonu			100 mL başına miktar: 10 mL 5 M NaOH çözeltisi, 20 mL %5 Sodyum Hipoklorit Çözeltisi ve 70 mL steril su
S Bazal			Litre başına miktar: 5,85 gram NaCl, 6 gram KH₂PO₄, 1 gram K₂HPO₄ ve 1 Litre mili-Q su
Agar	USBiyolojik Yaşam Bilimleri	A0930 Serisi
NaCl	USBiyolojik Yaşam Bilimleri	S5000 Serisi
Pepton	USBiyolojik Yaşam Bilimleri	P3300 Serisi
CaCl₂	USBiyolojik Yaşam Bilimleri
MgSO₄	Fisher Bilimsel	M63-500 Serisi
Fosfat tamponu			litre başına miktar: 132 mL K₂HPO₄ (1M) ve 868 mL KH₂PO₄ (1M)
KH₂PO₄	Acros Organik	7778-77-0
K₂HPO₄	USBiyolojik Yaşam Bilimleri	P5100 Serisi
%5 Sodyum Hipoklorit Çözeltisi	BICCA	7495.5-32
NaOH çözümü	Fisher Bilimsel	SS255-1 Serisi
Rahat nefes alın	Çeşitlendirilmiş Biyoteknoloji	BEM-1
SYTOX Turuncu Nükleik Asit Boyası	Fisher Bilimsel	S11368
Bakteriyel Suşlar
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis (OG1RF)
E. coli süper gıda (OP50)
E. koli RNAi eksprese eden bakteriler (HT115)
Solucan Suşları
glp-4(bn2) (Beanan ve Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP muhabiri (Kang ve diğerleri, 2018, PMID: 29532717)