RNAi Eksprese Eden Bakterilerin Kültürlenmesi ve Bakımı

Özet

Kaynak: Anderson, Q.L., vd., Yüksek verimli, Yüksek içerikli, Sıvı bazlı C. elegans Patosystem. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, hedef gen ekspresyonunu inhibe etmek için plazmit taşıyan RNA interferans (RNAi) bakterilerinin hazırlanmasını göstermektedir. Aşağı akış tahlilleri için dsRNA eksprese eden plakalar üretmek için RNAi bakteri seçimi, büyümesi ve indüksiyon adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

Protokol

1. RNA interferans (RNAi) Bakterilerinin hazırlanması

1. İstenen RNAi içeren bakteri suşlarını, uygun antibiyotikler (Ahringer ve Vidal kütüphaneleri için 100 μg/mL'de karbenisilin ve 15 μg/mL'de tetrasiklin) içeren lizojeni suyu (LB) agar plakalarına çizin veya pimle aktarın.
   Not: Patojenik olmayan bakterilerle çalışırken, kültürlerin sterilitesini sağlamak ve kütüphanenin çapraz kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için bir biyogüvenlik seviyesi (BSL)-2 A/B biyolojik güvenlik kabini veya bir BSL-1 laminer akış başlığı kullanın.
2. Plakaları 37 °C'de 24 saat inkübe edin.
3. Plakaları iki haftaya kadar 4 °C'de saklayın.
   1. İki hafta sonra plakaları atın ve yeni yapılmış plakalarla değiştirin.
4. Her klondan tek bir koloniyi, 24 oyuklu derin oyuklu bir plakanın tek bir kuyucuğunda veya steril bir test tüpüne 4 mL karbenisilin takviyeli LB'ye ayrı ayrı aşılayarak birden fazla RNAi suşunu paralel olarak test edin.  
   Not: Tetrasiklinin RNAi'nin etkinliğini azalttığı bildirilmiştir. Bu ortamda kullanmayın.
5. 24 oyuklu derin kuyucuklu plakaları, çok kuyulu plakalar için optimize edilmiş çalkalamalı bir inkübatöre yerleştirin ve 950 rpm'de çalkalarken 37 °C'de 16 saat inkübe edin. Not: Geleneksel bir çalkalamalı inkübatör kullanarak çok kuyulu plakalarda tek tip bakteri üremesi elde etmek zordur. Kültürlerin düzgün bir şekilde büyümesi için çalkalama inkübatörü en az 750 rpm'de çalkalayabilme özelliğine sahiptir. Özel bir çalkalayıcının yokluğunda, her kültürü ayrı bir tüpte büyütmek mümkündür. Kültürler daha sonra santrifüjleme için 24 oyuklu plakaya aktarılabilir.
6. 2.000 x g'da 5 dakika santrifüj ederek bakterileri toplayın.
7. Plakayı ters çevirerek ve kuvvetlice çalkalayarak süpernatanı boşaltın. RNAi bakterilerini 100 μL S Bazal (5.85 g sodyum klorür, NaCl; 1 g dipotasyum fosfat, K₂HPO₄; 6 g monopotasyum fosfat, KH₂PO₄ , 1 L ultra saf su içinde çözülür ve otoklav ile sterilize edilir).
8. Pipet, bakterileri çok kuyulu bir NGM plakasının uygun sayıda kuyucuğuna yeniden süspanse etti (Nematod büyüme ortamı, 3 g NaCl, 2.5 g pepton, 1 mM kalsiyum klorür, CaCl₂; 1 mM magnezyum sülfat, MgSO₄; 25 mL fosfat tamponu (litre başına miktar: 132 mL K₂HPO₄ (1 M) ve 868 mL KH₂PO₄ (1M)) ve litre su başına 18 g agar) IPTG (İzopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid; 1 mM nihai konsantrasyon) ve karbenisilin (100 μg/mL nihai konsantrasyon) ile desteklenmiştir.
   1. 6 oyuklu bir plakanın kuyucuğu başına 3,5 mL, 24 oyuklu bir plakanın kuyucuğu başına 1 mL veya 96 oyuklu bir plakanın kuyucuğu başına 150 μL NGM ortamı kullanın.
   2. 6 oyuklu bir plaka için 100 μL/kuyu, 24 oyuklu bir plaka için 50 μL/kuyu veya 96 oyuklu bir plaka için 20 μL/kuyu bakteri kullanın. Kurumasını bekleyin.
      Not: Kurutma, hızlı ve homojen bir kurumayı teşvik etmek için normalde steril bir akış başlığında gerçekleştirilir. Düzgün kurutma çok önemlidir. Agardaki çatlaklar solucanların oyulmasını teşvik ettiğinden aşırı kurutmadan kaçının. Bu, solucan kayıplarına ve sıvı taşıma sistemlerinin potansiyel olarak tıkanmasına yol açar.
9. Hazırlanan plakaları hemen kullanın veya daha sonra kullanmak üzere iki haftaya kadar 4 °C'de saklayın.
   Not: Plakaların kurumasını önlemek için plastik parafin filmle kapatılabilir veya nemli kağıt havlularla sıkıca kapatılmış bir kaba yerleştirilebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
24 derin kuyu RB bloğu	Thermo Fisher Bilimsel	CS15124
Nematod büyüme ortamı (NGM)			Litre başına miktar: 18 gram agar, 3 gram sodyum klorür, 2.5 gram Pepton, 1 mL kalsiyum klorür (1 M), 1 mL magnezyum sülfat (1 M), 25 mL fosfat tamponu ve 973 mL mili-Q su
Lizojeni Suyu (LB)	USBiyolojik Yaşam Bilimleri	L1520 Serisi
S Bazal			Litre başına miktar: 5,85 gram sodyum klorür, 6 gram monopotasyum fosfat, 1 gram dipotasyum fosfat ve 1 litre mili-Q su
Agar	USBiyolojik Yaşam Bilimleri	A0930 Serisi
Sodyum klorür	USBiyolojik Yaşam Bilimleri	S5000 Serisi
Pepton	USBiyolojik Yaşam Bilimleri	P3300 Serisi
Kalsiyum klorür	USBiyolojik Yaşam Bilimleri
Magnezyum sülfat	Fisher Bilimsel	M63-500 Serisi
Fosfat tamponu			Litre başına miktar: 132 mL dipotasyum fosfat (1 M) ve 868 mL monopotasyum fosfat (1 M)
Monopotasyum fosfat	Acros Organik	7778-77-0
Dipotasyum fosfat	USBiyolojik Yaşam Bilimleri	P5100 Serisi