$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Bakteriyel Biyolüminesans Suşların İfadesi
NOT: Bakteriyel biyolüminesans suşlar, büyüme ve ışık üretimi için özel büyüme ortamı/yapay deniz suyu ortamı gerektirir.
- Ayrı ayrı hazırlanmış iki ortam bileşeninden oluşan yapay bir deniz suyu ortamı hazırlayın.
NOT: Aşağıdaki miktarlar 1 L sıvı ortam veya 1 L agar ortamı içindir.- Yapay deniz suyu ortamı için aşağıdaki tuzları tartın: 28.13 g NaCl (sodyum klorür), 0.77 g KCl (potasyum klorür), 1.60 g CaCl2 · 2H2O (kalsiyum klorür dihidrat), 4.80 g MgCl2 · 6H2O (magnezyum klorür heksahidrat), 0.11 g NaHCO3 (sodyum bikarbonat) ve 3.50 g MgSO4 · 7H2O (magnezyum sülfat heptahidrat).
- 1 L damıtılmış su ekleyin ve tüm bileşenleri çözün.
- LB (Luria-Bertani) ortamı için aşağıdaki bileşenleri tartın: 10 g maya özütü, 10 g pepton ve agar plakaları için ek 20 g agar.
- 250 mL musluk suyu ekleyin ve bileşenleri çözün.
- Her iki hazırlanmış ortamı ayrı ayrı 121 °C'de 20 dakika otoklavlayın.
- Agar plakaları için, otoklavlamadan hemen sonra 250 mL LB ortamını 750 mL yapay deniz suyu ortamıyla birleştirin ve plakaları hazırlayın.
- Sıvı ortam için, 250 mL LB ortamını 750 mL yapay deniz suyu ortamıyla doğrudan otoklavlamadan sonra veya soğutulduğunda birleştirin.
NOT: Yapay deniz suyu ortamı, tuz çökelmesi yoluyla bulanıklaşabilir.
- Bakteriyel biyolüminesans suşlarını yapay deniz suyu orta agar plakaları üzerine çizin ve gece boyunca 24 - 30 °C'de inkübe edin.
NOT: Bakteri suşlarının uzun süreli depolanması normalde bakteri kültürünün gliserol stoklarının dondurulmasıyla sağlanır. Çözülmeden sonra büyümede bir gecikme fazı nedeniyle, sıvı kültürler için kullanılmadan önce, tüm suşlar için tek tip başlangıç koşulları sağlamak için suşlar her zaman önce agar plakaları üzerinde çizilmelidir. - Plakadan tek bir koloni ile 100 mL yapay deniz suyu ortamını aşılayarak bir ONC (gece kültürü) hazırlayın. ONC'yi gece boyunca bir inkübatör çalkalayıcısında 24 - 30 °C'de ve 120 rpm'de inkübe edin.
- 800 mL yapay deniz suyu ortamını 8 mL ONC ile aşılayın.
- Bakteri hücrelerini 24 - 30 °C'de ve 120 rpm'de bir inkübatör çalkalayıcıda inkübe edin.
NOT: Biyolüminesans bakterilerin ışık yoğunluğu profili, sıcaklığa göre büyük ölçüde değişir. İlgili bakteri suşunun ışık üretiminin düzenleyici mekanizmalarına bağlı olarak, ışık emisyonu yaklaşık 1 - 6 saat sonra başlayabilir. - Bakteri hücre kültürünü parlamaya başlayana kadar gözlemleyin (yaklaşık 1 - 6 saat).
NOT: İfadenin amacına göre hücreler ertesi güne kadar büyütülür ve daha sonra hasat edilir veya hücreler parladığı sürece sallanmaya devam edilebilir. Hücrelerin toplanması ve herhangi bir proteinin saflaştırılması standart prosedürlere göre yapılabilir.