Mikroakışkan Odalar Kullanılarak Stres Altında Bakteri Büyümesinin Mikroskobik Analizi

Özet

Kaynak: Cayron, J., ve diğerleri. Stres Tedavileri Altında Bakteriyel Büyümenin Çok Ölçekli Analizi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, stres koşulları altında bakteri hücrelerini görüntülemek için mikroakışkan bir plakanın nasıl hazırlanacağını ve kullanılacağını gösterir. Bir bakteri kültürü ve strese neden olan bir antibiyotik ortamının tanıtılması, ardından hücre yüklemesi ve mikroskobik kurulum sürecini ana hatlarıyla belirtir. Faz kontrast modunda hızlandırılmış görüntüleme daha sonra, inhibe edilmiş hücre bölünmesi nedeniyle artan DNA içeriğine sahip uzun, ipliksi hücrelerin gelişimini gözlemlemek için kullanılır.

Protokol

1. Mikroakışkanlar hızlandırılmış mikroskopi görüntüleme
   1. Koruma solüsyonunu mikroakışkan plakadan çıkarın ve mikroakışkan yazılım kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi önceden 37 °C'ye ısıtılmış taze ortamla değiştirin.
   2. Mikroakışkan plakayı manifold sistemine kapatın ve Hazırlama düğmesine tıklayın.
   3. Mikroakışkan plakayı manifold sistemli mikroskop tablasına yerleştirin ve mikroskopi alımına başlamadan önce 37 °C'de ~2 saat ön ısıtma yapın.
      NOT: Bu ön ısıtma adımı, hızlandırılmış deney sırasında mikroskobun odağını değiştirecek ve görüntü elde etmeyi tehlikeye atacak mikroakışkan odanın genişlemesini önlemek için kritik öneme sahiptir.
   4. Mikroakışkan plakayı kapatın. Kuyu 8'deki ortamı 150 μL kültür numunesi ile değiştirin ve kuyu 1'den 5'e kadar olan ortamı, strese neden olan reaktif olsun veya olmasın istenen ortamla değiştirin.
   5. Mikroakışkan plakayı kapatın ve mikroskop tablasına yerleştirin.
   6. Mikroakışkan yazılımda hücre yükleme prosedürünü çalıştırın. İletilen ışıkta mikroskop altına bakarak hücrelerin yüklenmesinin tatmin edici olup olmadığını kontrol edin. Odadaki hücre yoğunluğu yetersizse hücre yükleme prosedürünü ikinci kez çalıştırın.
   7. İletilen ışık modunda dikkatli odaklama yapın ve izole edilmiş bakterileri gösteren birkaç görüş alanı seçin. İzole edilmiş hücrelerin zaman içindeki büyümesini izleyebilmek için aşırı kalabalık olmayan alanların seçilmesi önemlidir (100 μm² başına ~10-20 hücre önerilir). Bu aynı zamanda görüntü analizi sırasında hücre tespitini de kolaylaştıracaktır.
   8. Mikroakışkan yazılımda, Protokol Oluştur düğmesine tıklayın. Hücrelerin uyum sağlamasına izin vermek için büyüme ortamının enjeksiyonunu 1-2 nesil zaman eşdeğerleri için programlayın (isteğe bağlı). Daha sonra strese neden olan ortamın enjeksiyonunu 10 dakika boyunca 2 psi'de programlayın, ardından stres tedavisinin istenen süresi boyunca 1 psi'de enjeksiyon yapın. Stres sonrası hücrelerin iyileşmesini analiz etmeyi düşünüyorsanız, taze büyüme ortamının enjeksiyonunu istenen süre boyunca programlayın.
      NOT: Burada sunulan deneyde, sefaleksin 2 psi'de 10 dakika, ardından 1 psi'de 50 dakika enjekte edildi. Daha sonra, taze büyüme ortamı 10 dakika boyunca 2 psi'de, ardından 1 psi'de 3 saat enjekte edildi.
   9. İletilen ışıkta faz kontrastı ve gerekirse mCherry sinyali için 560 nm uyarma ışık kaynağı kullanarak her 10 dakikada bir 1 kare ile hızlandırılmış modda mikroskopi görüntüleme gerçekleştirin.
      NOT: Mikroakışkan enjeksiyon protokolünün başlamasıyla aynı anda mikroskobik görüntü alımına başlamak önemlidir.

Malzemeler