Gradyan İnhibitör Plakası Kullanarak Bakteri Sürüsünün Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Guo, S., ve diğerleri. İndükleyici gradyan plakalarında bakteri yüzeyi sürü hareketliliğinin ölçülmesi. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, değişen inhibitör konsantrasyonları altında bakteri sürü davranışını incelemek için çift katmanlı gradyan sürü plakasının kullanımını göstermektedir. Alt tabakada gradyan oluşturan bir inhibitör bulunan bir plaka bakteri ile aşılanır ve inkübe edilir. İnhibitör konsantrasyonunun bakteri sürüsü üzerindeki etkisini analiz etmek için düzenli aralıklarla görüntüler yakalanır.

Protokol

1. Degrade sürü plakalarının hazırlanması

1. Sürü ortamının hazırlanması
   NOT: Bu protokolde sürü ortamının %0.7 (a/h) agar konsantrasyonu kullanılmıştır.
   1. Lizojeni suyu (LB) tozunu iki konik şişede agar ile hazırlayın; her şişe 2 g tripton, 2 g sodyum klorür (NaCl), 1 g maya özütü ve 1.4 g agar içerir. Çift damıtılmış su (ddH₂O) ekleyin ve süspansiyonu manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak karıştırın. Ek ddH 200 O ekleyerek son hacmi₂mL'ye ayarlayın.
   2. Çözeltiyi 121 °C'de 20 dakika otoklavlayın. Hava geçirgen bir kapak veya havalandırma deliği olan şişe sızdırmazlık filmi kullanın.
      NOT: Agar otoklavda ısıtıldığında çözülür.
   3. Sıcaklık 65 dereceye düştüğünde, homojenliği sağlamak için çözeltiyi karıştırın ve ortamı kısa süreli kullanım için 65 °C'lik bir inkübatöre veya su banyosuna aktarın.
2. Alt katman sürü ortamının hazırlanması
   NOT: Alt katman ortamı, sürü ortamı ve indükleyici stok çözeltilerinin karışımıdır. İndükleyici gradyan sürü plakalarının formülasyonu Tablo 1'de gösterilmektedir.
   1. 114,12 mg liyofilize resveratrol tozunu 5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözerek 100 mM'lik bir resveratrol stok çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi -20 derecede saklayın.
   2. 6 g arabinoz tozunu 30 mL_ddH2O içinde çözerek %20 (a/h) arabinoz stok çözeltisi hazırlayın; arabinozun çözülmesine izin vermek için 10-15 dakika bekleyin; ve çözeltiyi oda sıcaklığında saklayın.
   3. Ortamı 65 °C inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına yerleştirin; Erlenmeyer şişesi tutacak kadar soğuyana kadar (~50 °C) sürü ortamının soğumasını bekleyin. Agarın katılaşmasına neden olacağından, sürü ortamını uzun süre oda sıcaklığında tutmayın.
   4. İndükleyici stok çözeltisinin gerekli hacmini 50 °C'de sürü ortamına ekleyin (Tablo 1). İndükleyici çözeltiyi dökmek yerine dağıtmak için bir pipet kullanın. İndükleyiciyi sürü ortamıyla karıştırmak için hafifçe döndürün.
      NOT: Bu adım, otoklavlanamayan indükleyiciler içindir. Ortama kabarcık sokmamaya dikkat edin.
3. Çift katmanlı gradyan sürü plakalarının hazırlanması
   NOT: Üst katman ortamı, %0.7 (a/h) agar içeren LB ortamıdır.
   1. 13 x 13 cm'lik kare Petri kaplarını indükleyici adı ve suşları ile etiketleyin ve kapları kapakların kenarından destekleyin (Şekil 1B).
   2. 50 mL'lik bir pipet veya 50 mL'lik bir santrifüj tüpü kullanarak 40 mL ılık alt katman ortamı (50 °C) ekleyin.
      NOT: Alternatif olarak, 13 x 13 cm kare Petri kapları için 40 mL alt katman ve üst katman ortamı uygundur; 10 x 10 cm kare Petri kapları için 25 mL alt katman ve üst katman ortamı uygundur.
   3. Alt katman ortamının laminer bir akış başlığı içinde 1 saat boyunca açıkta kürlenmesine izin verin. Ortam katılaşırken kare Petri kaplarını rahatsız etmeyin.
      NOT: Alt tabaka kürlenirken, indükleyici içermeyen sürü ortamı 65 °C'lik bir inkübatörde veya su banyosunda tutulmalıdır.
   4. Alt katman tamamen katılaştığında kapakları çıkarın ve kare Petri kaplarını laminer akışlı bir başlığın içine yerleştirin.
   5. 50 mL'lik bir pipet veya 50 mL'lik bir santrifüj tüpü kullanarak 40 mL ılık üst katman ortamı (50 °C) ekleyin.
      NOT: Üst katman ortamı indükleyici içermez.
   6. Çift katmanlı plakaları tezgah üzerinde, üstü kapalı ve rahatsız edilmeden 1 saat kürleyin. Hazırlanan plakaları 4 °C'de 24 saate kadar saklayın.NOT: Daha uzun kürlenme süreleri nem içeriğini azaltacak ve oğul hareketliliğini kısıtlayacaktır.

2. E. coli K12 ve P. aeruginosa PAO1'in büyümesi

1. ddH2O'ya 5 g tripton, 5 g NaCl ve 2.5 g maya özütü ekleyerek 500 mL LB ortamı hazırlayın ve çözeltiyi 500 mL'ye doldurun. Çözeltiyi sıvı döngüsünde 121 °C'de 20 dakika otoklavlayın ve 4 °C'de saklayın.
2. _ddH2O'ya 1 g tripton, 1 g NaCl, 0.5 g maya özütü ve 1.5 g agar ekleyerek 100 mL %1.5 (a/h) LB-agar ortamı hazırlayın ve çözeltiyi 100 mL'ye doldurun. Çözeltiyi 121 °C'de 20 dakika boyunca sıvı döngüsünde otoklavlayın. Agarın katılaşmasını önlemek için ortamı 50 °C'lik bir su banyosuna aktarın.
3. LB-agar orta boy şişenin tutulması rahat olduğunda, 25 mL'lik bir pipet kullanarak bir Petri kabına (10 cm çapında) 20 mL LB-agar ortamı ekleyin. Plakayı gece boyunca oda sıcaklığında bırakın ve LB-agar plakasını 4 °C'de saklayın.
4. -80 °C'de saklanan stok kültürleri, tek kullanımlık aşılama döngüleri kullanarak LB-agar Petri kapları üzerinde E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 ve P. aeruginosa PAO1-YdeH suşlarını alın. Petri kaplarını gece boyunca 37 °C'de ters çevrilmiş olarak inkübe edin.
5. Petri kaplarından farklı suşlar için tek koloniler seçin, her koloniyi 5 mL LB ortamına aşılayın ve kültürü 220 rpm'ye ayarlanmış bir laboratuvar orbital çalkalayıcıda 37 °C'de inkübe edin.
6. Kültür yoğunluğu OD600nm ~1.0'a ulaştığında, kültürü çalkalayıcıdan çıkarın ve oda sıcaklığına yerleştirin. Kültür yoğunluğunu, adım 3.2.1'de açıklandığı gibi OD600nm = 1.0'a ayarlayın.

3. Gradyan sürü plakalarının aşılanması ve inkübasyonu

1. Aşılama kuyularının hazırlanması
   NOT: Aşağıda açıklanan yöntem yerine standart bir mesafe ile ayrılmış kuyular oluşturabilen 3D baskı kapak modelleri kullanılabilir.
   1. Kuyu konumlarını Şekil 4C'de gösterildiği gibi A1 kağıdına işaretleyin. İki veya üç tekrarlı bir kare Petri kabına üç test konsantrasyonu ayarlayın.
   2. İşaretli A4 kağıdını katılaştırılmış bir degrade plakanın altına yerleştirin. 100 μL'lik bir pipet ucunun geniş tarafını işaretli konumda yarı katı ortam yüzeyine doğru itin. Pipet ucunu üst katman ortamının dibine ulaşana kadar bastırın.
   3. Uç tabana değdiğinde, uca dikey kuvvet uygulamayın; silindirik kuyunun içeriğini izole etmek için ucu yavaşça döndürün.
   4. Ayrılan dar alana hava akışını sağlamak için pipet uçlarını çok küçük bir mesafe boyunca yatay olarak hareket ettirin. Başparmağınızı ve orta parmağınızı kullanarak pipeti tutarken ucun içindeki gaz akışını engellemek için uca işaret parmağınızla bastırın.
   5. Ucu dikey olarak dışarı çekin, dışarı çekerken kuyu içeriğini uçta tutun.
      NOT: Kuyu içeriği kayarsa, ucu tamamen kapatmak için işaret parmağınızla biraz daha fazla basınç uygulayın.
   6. İşaretli her konumda 3.1.2 ila 3.1.5 arasındaki adımları tekrarlayın. Aşılamadan önce sürü plakasını örtün.
2. Gradyan plaka aşılama ve inkübasyon
   1. Gecelik büyüme kültürü yoğunluğunu OD600nm = 1.0 olarak ayarlayın.
   2. Her kuyucuğa 80 μL gece büyüme kültürü pipetleyin. Bakteri kültürünü kuyuların dışına dökmeyin.
   3. Plakaları sızdırmazlık filmi ile sarın. Uzun süreli gözlem için (3-5 gün), plakaları steril laboratuvar lastik bandı ile sarın.
      NOT: Lastik bandın kırılma olasılığı daha düşüktür.
   4. İnkübatörün içindeki nemi korumak için inkübatöre ddH₂O ile dolu bir beher yerleştirin. Gradyan sürü plakalarını 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: Sürü plakalarını baş aşağı inkübe etmeyin; Bu, bakteri kültürünün kuyulardan sızmasına neden olacaktır.
   5. Aşılamadan hemen sonra sürü plakasını görüntüleyin ve bunu 0 saatlik zaman noktası olarak kaydedin.

4. Bakteri yüzey sürüsünün görüntülenmesi

1. Sürü plakalarını her 12 saatte bir inkübatörden teker teker çıkarın, plakayı yatay tutun ve jel görüntüleme sistemine yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın).
   NOT: Plakaların yüzeyinde parmak izi bırakmayın; Sürü plakasının yan tarafını temiz eldivenlerle tutun.
2. Jel görüntüleme modunu seçin; sürü plakasını beyaz ışığa maruz bırakın; ve sürülerin en net görüntüsünü vermek için odak uzaklığını ayarlayın.
   NOT: Belirli bir partideki tüm plakalar için aynı odak uzaklığını kullanın.
3. Pozlama süresini 300 ms'ye ayarlayarak net gözlem için sürülerin parlaklığını artırın. Arka plan ışığından kaynaklanan paraziti en aza indirmek için eşiği ayarlayın.
   NOT: Eşik, jel görüntüleme sisteminin çalışma arayüzünde ayarlanır. Arka plan ışığından kaynaklanan paraziti en aza indirmek için soldaki değerleri artırın; Sürülerin parlaklığını artırmak için sağdaki değerleri azaltın. Bu protokolde bölge genellikle 6.000 ile 50.000 arasındadır.
4. Daha fazla analiz için görüntü dosyasını kaydedin. Görüntüleme süresini, indükleyici tipini, gradyan yönünü ve gerinimleri bir .txt dosyasına kaydedin.

 

Tablo 1: Çift katmanlı sürü ortamı özellikleri.

Üst katman orta/lizojeni et suyu ortamı (100 mL başına)
Tripton: 1 g
Sodyum klorür: 1 g
Maya özü: 0,5 g
Agar: 0.7 g
Alt katman ortamı/İndükleyici içeren ortam (100 mL başına)
Tripton: 1 g	Çalışma konsantrasyonu:	Stok çözelti konsantrasyonu:
Sodyum klorür: 1 g
Maya özü: 0,5 g	- Resveratrol: 400 μM	- Resveratrol: 100 mM
Agar: 0.7 g
İndükleyici:	- Arabinoz: %0,5 (a/h)	- Arabinoz: %20 (a/h)
- Resveratrol stok çözeltisi: 400 μL	veya %1 (w/v)
- Arabinoz stok çözeltisi: 2,5 mL veya 5 mL

Sonuçlar

Şekil 1: İndükleyici gradyan sürü plakası hazırlama, aşılama ve inkübasyon şeması. (A) 37 °C'de bakteri kültürünün gece boyunca büyümesi. (B) Çift katmanlı indükleyici gradyan sürü plakasının iş akışı. i) Kare Petri kaplarını destekleyin. ii...

Malzemeler