Rekombinant Protein Üretimi ve Bakteri Kaynaklı Veziküllerden Geri Kazanım

Özet

Kaynak: Streather, B. R., ve diğerleri. E. coli'den Rekombinant Protein Dolu Veziküllerin Optimize Edilmiş Üretimi ve Analizi. J. Vis. Uzm. (2023)

Bu video, Vezikül Çekirdekleştirici Peptit (VNp) ile etiketlenmiş rekombinant proteinlerin bakteriyel veziküllerden üretimini ve izolasyonunu göstermektedir. Bir indükleyici, VNp etiketli protein ekspresyonunu tetikler, vezikül oluşumunu ve kapsüllemeyi yönlendirir, ardından hücre lizizi olmadan verimli protein geri kazanımı için santrifüjleme ve sonikasyon yapılır

Protokol

1. Bakteriyel hücre kültürü ve protein indüksiyonu

1. T7 promotöründen rekombinant protein ekspresyonunu indüklemek için, 20 μg/mL'ye (84 μM) kadar nihai konsantrasyona izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ekleyin. Rekombinant protein ekspresyonunun indüksiyonu, veziküllerin üretimi için geç log fazında (yani, tipik optik yoğunluk, OD₆₀₀ 0.8-1.0) gerçekleşmelidir. ​
   NOT: İndüksiyon periyodunun uzunluğu proteinler arasında farklılık gösterebilir, bazıları 4 saatte ve diğerleri gece boyunca (18 saat) maksimum üretime ulaşır. Bugüne kadar, gecelik kültürlerde maksimum vezikül ihracatı elde edilmiştir.

2. Rekombinant vezikül izolasyonu

1. Hücreleri 20 dakika boyunca 3.000 x g'da (4 °C) santrifüjleme ile pelet haline getirin.
2. Vezikül içeren ortamı uzun süreli depolama için sterilize etmek için, temizlenmiş kültür ortamını steril ve deterjan içermeyen 0,45 μm polietersülfon (PES) filtreden geçirin.
   NOT: Canlı hücrelerin vezikül içeren süzüntüden dışlanmasını test etmek için, lizojeni suyu (LB) agar üzerine plakalayın ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
3. Vezikülleri daha küçük bir hacme konsantre etmek için, steril vezikül içeren ortamı steril ve deterjan içermeyen 0,1 μm karışık selüloz esterleri (MCE) filtresinden geçirin.
4. Vezikülleri membrandan dikkatlice çıkarmak için membranı bir hücre kazıyıcı veya plastik yayıcı kullanarak 0,5-1 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile nazikçe yıkayın. Yeni bir mikrofüj tüpüne aktarın. ​
   NOT: Saflaştırılmış veziküller steril ortamda veya PBS'de 4 °C'de saklanabilir. Bu veziküllerde 6 ay boyunca saklanan rekombinant protein örnekleri vardır, bu şekilde enzimatik aktivitede herhangi bir kayıp olmaz.

3. İzole edilmiş veziküllerden çözünür protein salınımı

1. Protein içeren veziküller steril ortama/tampona izole edildikten sonra, veziküler lipid membranlarını aparat için uygun bir program kullanarak sonikasyona tabi tutun (örneğin, 6x 20 s açık ve kapalı döngüler) ve vezikül kalıntılarını gidermek için 20 dakika boyunca 39.000 x g'da (4 ° C) santrifüjleyin. NOT: Vezikülleri kırmak için bir alternatif olarak ozmotik şok veya deterjan işlemi kullanılabilir, ancak protein işlevselliği ve/veya aşağı akış uygulaması üzerindeki etkisi dikkate alınmalıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İzopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG)	Melford Belediyesi	367-93-1
Lizojeni Suyu (LB) / LB agar	Laboratuvar Stoku	NA	10 g/L Tripton; 10 g/L NaCl; 5 g/L Maya Ekstraktı (1,5 g/L agar)
MF-Millipore Membran filtre (0,1 μm, MCE)	Merck	VCWP04700
Millipore Express PLUS membran filtre (0,45 μm, PES)	Merck	HPWP04700
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Laboratuvar Stoku	NA