E. coli'de F Plazmid Transferi ve İkili Antibiyotik Seçimi

Özet

Kaynak: Erdoğan, F., ve diğerleri, Bakteriyel Konjugasyonda Yer Alan Transfer Proteinlerinin Diziye Özgü Analizi için Konjugatif Çiftleşme Deneyleri. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, bir kurtarma plazmidi kullanarak bir F plazmitinin donörden alıcı E. coli hücrelerine aktarılması ve ikili antibiyotik direnci yoluyla transkonjuganların seçilmesi prosedürünü göstermektedir. İşlem, bakteri kültürlerinin karıştırılmasını, çalkalanmadan inkübasyonu, çiftleşme çiftlerinin bozulmasını ve başarılı plazmit transferini doğrulamak için seçici ortam üzerine kaplamayı içerir.

Protokol

1. XK1200 Donörlerinden MC4100 Alıcılarına Konjugatif Çiftleşme Testi

1. 20 μg / mL kloramfenikol (Cm), 50 μg / mL kanamikol (Km) ile 20 mL steril Lizojeni suyu (LB) içinde XK1200 pOX38-Tc Δgen::Cm + pK184-gen hücrelerinin bir O / N kültürü hazırlayın ve MC4100 hücreleri 50 μg / mL streptomisin (Sm) ile 5 mL LB'de bir agar plakası ve steril pipet veya halka üzerinde bir gliserol stoğundan veya tek koloniden hücreler kullanarak. Kültürleri 37 °C'de 200 rpm çalkalayarak büyütün.
2. Aynı antibiyotiklerle 2 mL steril LB'de her O/N kültüründen ayrı ayrı 1:70 seyreltme yapın. Tüm donör hücrelere 100 mM'lik bir nihai konsantrasyona glikoz ekleyin. Hücreleri₂₀₀ rpm'de çalkalayarak 37 °C'de orta log fazına (OD 600 0.5-0.7) büyütün.
3. Pelet hücrelerine santrifüj (4.000 x g) 4 °C'de 5 dakika, süpernatanı atın, antibiyotikleri çıkarmak için bir kez soğuk steril LB ile yıkayın ve hücreleri 2 mL soğuk steril LB'de yeniden süspanse edin.
4. İki kopya halinde, her kültürün 100 μL'sini 800 μL steril LB ortamına ayırın ve 37 °C'de 1 saat çalkalamadan çiftleşmelerine izin verin.
5. Çiftleşme çiftlerini bozmak için hücreleri 30 saniye vorteksleyin ve daha fazla çiftleşmeyi önlemek için 10 dakika boyunca buzun üzerine koyun.
6. Vorteksli karışımı ve taze steril LB'yi kullanarak, transkonjuganlardan 6 seyreltme (^10-2 ila ^10-7) hazırlayın. Şekil 1'deki gibi 50 μg/mL Sm ve 20 μg/mL Cm içeren agar plakalarının her bir yarısında her seyreltmenin 10 μL alikotunu tespit ederek transkonjugant MC4100 pOX38-Tc Δgen::Cm hücreleri için seçim yapın. Her iki çift karışım için tekrarlayın. Alanı steril tutun ve alevin yakınında çalışın. O/N plakalarını 37 °C'de inkübe edin.

Sonuçlar

Şekil 1: Hedef genin konjugasyondaki işlevini değerlendirmek için çiftleşme testi. Donör ve alıcı hücreler sırasıyla pK184-TraF ve MC4100 ile dönüştürülmüş E. coli XK1200 pOX38-Tc ΔtraF::Cm idi. Ortaya çıkan tr...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Petri Kapları	Fisher Bilimsel	FB0875713
Antibiyotik			Nihai Konsantrasyonlar
Kloramfenikol (cm)	Fisher Bilimsel	BP904-100 Serisi	20 μg/mL
Kanamisin (Km)	BioBasic Inc.	DB0286 Serisi	50 μg/mL
Streptomisin (Sm)	Fisher Bilimsel	BP910-50 Serisi	50 μg/mL