Işıkla Aktive Olan Flavin Mononükleotid Kullanılarak Bakterilerin İnaktivasyonu

Özet

Kaynak: Cheng, C., ve diğerleri. riboflavin-5′-fosfatın görünür ışık fotolizi yoluyla patojenlerin inaktivasyonu. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, flavin mononükleotidinin (FMN) patojenik bakteriler üzerindeki fototoksik etkilerini değerlendirmek için bir yöntem göstermektedir. Bakteri kültürleri, artan FMN konsantrasyonlarına maruz bırakılır ve hücresel bileşenlere zarar veren reaktif oksijen türleri (ROS) üretmek için görünür ışıkla aydınlatılır. Hayatta kalan bakteriler daha sonra canlılıktaki doza bağlı azalmayı değerlendirmek için ölçülür.

Protokol

1. FMN fotolizi sonrası Staphylococcus aureus (S. aureus) canlılığı (Şekil 1)
   1. Bir S. aureus kolonisini (BCRC 10451) kültürlü bir plakadan 15 mL'lik vidalı kapaklı bir test tüpünde alınan 10 mL Lizojeni suyuna iletin. 37°C'de çalkalayıcıda 16 saat kültür.
   2. 0,5 mL kültürü 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Kültürü 600 nm'de (OD₆₀₀) 0,5 optik yoğunluğa seyreltmek için santrifüj tüpüne sterilize edilmiş su ekleyin (~6 x 10⁷ koloni oluşturan birim [CFU]/mL).
   3. 0.5 mL kültürü 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin ve bir hücre peleti elde etmek için süpernatanı boşaltın.
   4. 1 mL Riboflavin-5'-fosfat (veya flavin mononükleotidi; FMN)-tamponlu çözelti (potasyum fosfat tamponu [PB] içinde 30, 60 ve 120 μM FMN) adım 1.3'te olduğu gibi elde edilen hücre peletlerine ve girdap. Işınlanmış kontrol için tek başına 1 mL PB ekleyin.
   5. Tek başına 30 μM FMN ve PB içeren canlı bakteri hücre çözeltilerinin her biri 1 mL'yi cam tüplere aktarın ve bunları 30 dakika boyunca 10 W/^m2'de mor ışıkla ışınlayın.
   6. Tek başına 30, 60 ve 120 μM FMN ve PB içeren canlı bakteri hücre çözeltilerinin her biri 1 mL'yi cam tüplere aktarın ve 120 dakika boyunca 20 W /^m2'de mavi ışıkla ışınlayın. 120 μM FMN içeren 1 mL canlı bakteri hücre çözeltisi içeren başka bir cam tüp kurun ve 60 dakika boyunca 20 W/^m2'de mavi ışıkla ışınlayın.
   7. Test tüplerini adım 1.5 ve 1.6'da açıklandığı gibi kurun ve bunları kalın alüminyum folyo ile kaplayın. Bu tüpler karanlık kontroller görevi görür.
   8. Işınlama odasını (ve karanlık kontrolleri) 30-120 dakikalık ışınlama süresi boyunca 9 ± 1 °C'de soğuk bir odada tutun.
      NOT: Işık yayan diyot (LED) ışıkların açığa çıkardığı ısı göz ardı edilemez çünkü kabın içine yerleştirilen LED çipleri ışınlama deneyleri sırasında fotoreaksiyon sistemini ısıtabilir. Bu nedenle deneyler, 9 ± 1 °C'de tutulan soğuk bir odada gerçekleştirildi.
   9. Işınlamadan sonra, reaksiyon çözeltilerinin her birinden 0.2 mL'yi bir Luria agar (LA) plakasına aktarın. Bakterileri L şeklinde bir cam çubukla plakanın üzerine yayın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
   10. Gece boyunca büyümeden sonra S. aureus'un canlı plaka sayısını ve inaktivasyon oranlarını hesaplayın.

NOT: S. aureus'un inaktivasyon oranı, [1 -I / D] ×%100'e eşit olan yüzde azalma olarak hesaplanır, burada I ve D sırasıyla ışınlanmış numunedeki CFU sayısını ve karanlık kontrolü belirtir. Yüzde azalma, inaktivasyon oranının negatif bir değeri olarak tanımlanır.

Sonuçlar

Şekil 1: FMN fotolizinin S. aureus canlılığı üzerindeki etkisi.Yüzde azalma, (A) FMN ile muamele edilen S. aureus için 120 dakika boyunca 20 W/^m2'de mavi ışık ışınlaması a...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mavi, yeşil ve kırmızı LED ışıklar	Vita LED Technologies Co., Tainan, Tayvan		DC 12 V 5050
Dimetil Sülfoksit	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	190186
Kızılötesi termometre	Raytek Co. Santa Cruz, Kaliforniya	MT4 Serisi
LB et suyu	Difco Co., NJ
L-Metiyonin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	1.05707
NBT	Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Kanada
Güç kaynağı	China tech Co., Yeni Taipei Şehri, Tayvan	YP30-3-2
Riboflavin 5′-fosfat	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	R7774 Serisi
RNase	New England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
Güneş enerjisi ölçer	Tenmars Elektronik A.Ş., Taipei, Tayvan	TM-207 Serisi
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Biyokaynak Toplama ve Araştırma Merkezi (BCRC), Hsinchu, Tayvan	10451
UV-Vis optik spektrometre	Okyanus Optiği, Dunedin, FL	USB4000
UV-Vis spektrofotometresi	Hitachi Yüksek Teknoloji Bilim Şirketi, Tokyo, Japonya	U-2900 Serisi
Mor LED	Long-hui Elektronik A.Ş., LTD, Dongguan, Çin