Reaktif Oksijen Türlerinin Üretimi Yoluyla Işık Kaynaklı Bakteriyel İnaktivasyonun Miktarının Belirlenmesi

Özet

Kaynak: Cheng, C., ve diğerleri. riboflavin-5′-fosfatın görünür ışık fotolizi yoluyla patojenlerin inaktivasyonu. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu videoda, L-metiyonin, nitro mavi tetrazolyum (NBT) ve flavin mononükleotidi (FMN) içeren tamponlu bir reaksiyon karışımı, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini indüklemek için mor ışıkla ışınlanır. Bu, bakteriyel inaktivasyona ve spektrometrik olarak saptanabilir formazan oluşumuna yol açar.

Protokol

1. Staphylococcus aureus'ta Reaktif Oksijen Türlerinin (O₂•⁻) Tespiti

1. Staphylococcus aureus örneklerini hazırlayın.
2. Numunelerin bakteri yoğunluğunu sterilize su ile 600 nm'de 0,5 optik yoğunluğa seyreltin (OD (Optik yoğunluk)₆₀₀, ~6 x 10⁶ CFU (Koloni oluşturan birim) /mL). 0,5 mL kültürü 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin ve bir hücre peleti elde etmek için süpernatanı boşaltın.
3. 75 mL PB'ye (Fosfat tamponu) 0,1093 g L-metiyonin, 0,1 g NBT (Nitro mavisi tetrazolyum klorür) ve 25 mL FMN (Flavin mononükleotidi) (400, 240 veya 120 μM) ekleyin. Uygulanan her 1 mL reaktan için, FMN, metiyonin ve NBT'nin nihai konsantrasyonları sırasıyla 100 (60 veya 30) × ^10-6 M, 7.3 × ^10-3 M ve 1.2 × ^10-3 M'dir.
4. Elde edilen hücre peletlerine her bir reaktan çözeltisinden (yani değişen FMN konsantrasyonlarında) 1 mL ekleyin. Çözeltileri 10 W/^m2'de 10 dakika boyunca mor ışıkla ışınlayın.
5. Karışımı 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın. İndirgenmiş NBT'yi çıkarmak için peleti 1 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde yeniden süspanse edin. Üretilen O₂•⁻ türlerini 560 nm'deki absorbanstan tespit edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dimetil Sülfoksit	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	190186
Kızılötesi termometre	Raytek Co. Santa Cruz, Kaliforniya	MT4 Serisi
LB et suyu	Difco Co., NJ
L-Metiyonin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	1.05707
NBT (Nitro mavi tetrazolyum klorür)	Bio Basic, Inc. Markham, Ontario, Kanada
Güç kaynağı	China tech Co., Yeni Taipei Şehri, Tayvan	YP30-3-2
Riboflavin 5′-fosfat	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	R7774 Serisi
Güneş enerjisi ölçer	Tenmars Elektronik A.Ş., Taipei, Tayvan	TM-207 Serisi
Staphylococcus aureus subsp. aureus	Biyokaynak Toplama ve Araştırma Merkezi (BCRC), Hsinchu, Tayvan	10451
UV-Vis optik spektrometre	Okyanus Optiği, Dunedin, FL	USB4000
UV-Vis spektrofotometresi	Hitachi Yüksek Teknoloji Bilim Şirketi, Tokyo, Japonya	U-2900 Serisi
Mor LED	Long-hui Elektronik A.Ş., LTD, Dongguan, Çin