Antibiyotik Yüklü Polimerik Şeridin Antibakteriyel Etkinliğinin Belirlenmesi

Özet

Kaynak: Sekar, A., vd. al., İlaç Salınımlı Malzemelerin Uzunlamasına Antibakteriyel Aktivitesini Belirlemek İçin Yeni Bir Yöntem. J. Vis. Uzm. (2023)

Bu video, antibiyotiğe maruz kalan bakteri kültürlerinde azalan ATP güdümlü lüminesansı ölçerek antibiyotik yüklü bir polimerik şeridin antibakteriyel etkinliğini değerlendirmek için lüminesans bazlı bir tahlili göstermektedir.

Protokol

Zamana bağlı antibakteriyel aktivite etüdü düzeneği

1. Bakterileri gece boyunca 1 mL TSB (Triptik soya suyu) suyunda kültürleyin.
2. Gece boyunca yetiştirilen bakteri süspansiyonunu steril MHB'de (Mueller-Hinton suyu) 10⁵ CFU / mL'ye seyreltin ve deneye başlamadan önce lüminesans birimlerini kullanarak canlı bakteri sayısını doğrulayın.
3. İşlenmemiş UHMWPE (Ultra yüksek moleküler ağırlıklı polietilen) ve ilaç yüklü UHMWPE şeritlerini (3 mm x 5 mm x 10 mm) 3 mL'lik bir şırıngaya yerleştirin.
4. 10⁵ CFU/mL içeren MHB'yi, 1.35 mL MHB'ye eşdeğer olan 1.5 mL işaretine kadar ekli iğneden şırıngaya çekin (Şekil 1: Adım 1).
5. Şırınga kurulumunu belirtilen zaman noktalarına kadar 37 °C'de çalkalayan bir inkübatöre (100 rpm) yerleştirin: 6 saat, Gün 1, Gün 2, Gün 3, Gün 4, Gün 5, Gün 6 ve Gün 7 (Şekil 1: Adım 2).
6. Belirtilen her zaman noktasında, şırınga kurulumunu çıkarın ve 100 μL bakteri süspansiyonu üzerinde gerçek zamanlı bir mikrobiyal canlılık testi yapın (Şekil 1: Adım 3-4).
   1. Beyaz opak tabanlı 96 oyuklu plakalar kullanarak lüminesans bazlı testi gerçekleştirin.
   2. 100 μL seyreltilmiş bakteri süspansiyonunu 100 μL tahlil reaktifi ile karıştırın.
   3. Hazırlanan 96 oyuklu plakanın üzerine alüminyum folyo ile kaplı bir kapak yerleştirin ve 100 rpm çalkalayarak 5 dakika inkübe edin.
   4. Gen5 3.11 yazılımında aşağıdaki ayarları kullanarak lüminesansı bir mikroplaka okuyucu ile hemen ölçün.
      1. Görev Yöneticisi penceresinde bir protokol ayarlamak için Yeni'yi tıklayın.
      2. Plaka Tipi için açılır menüden Costar 96 beyaz opak öğesini seçin.
      3. Adımları > Eylemleri Seç menüsü altındaki Oku'ya tıklayın.
      4. Okuma Yöntemi penceresinde Lüminesans'a tıklayın. Uç nokta/kinetik ve Lüminesans fiber seçeneklerini sırasıyla okuma türü ve optik türü altında seçili tutun. Tamam'a tıklayın.
      5. Okuma Adımı penceresinde ayarları koruyun (kazanç = 135; entegrasyon süresi = 1 sn; okuma yüksekliği = 4,5 mm). Tamam'a tıklayın.
      6. Plaka düzeni penceresi çalıştırma için hazır görünür. Yük plakası penceresindeki Kapağı Kullan kutusunu işaretleyin ve Tamam'a tıklayın.
      7. Lüminesans değerlerini okumak için 96 oyuklu plakayı makineye yerleştirin.
7. 6 saat, Gün 1, Gün 2, Gün 3 ve Gün 7 zaman noktaları için canlı bakteri sayısını belirleyin. İlgili standart eğriyi kullanarak lüminesans birimlerinden CFU'yu (Koloni oluşturan birimler)/mL'yi belirleyin.
8. TSA (Triptik soya agar) plakaları üzerinde yayılmış plaka yöntemini uygulayarak ve gece boyunca 35 °C'de inkübe ederek, tespit sınırının altında lüminesans değerleri gösteren numunelerde canlı bakteri bulunmadığını doğrulayın. Ertesi gün kolonilerin varlığını kontrol edin.
9. Kalan bakteri süspansiyonunu 10 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin ve harcanan ortamı nazikçe aspire edin. İlaçların antibakteriyel aktivitesi nedeniyle peletlerin görsel olarak gözlemlenmediği tüpler için, görünmeyen peletlerin bozulmamasını sağlamak için tüpte 100 μL bırakın (Şekil 1: Adım 5).
10. Peletlenmiş bakterileri taze MHB'de yeniden süspanse edin ve bakteri süspansiyonunu ekli iğne aracılığıyla aynı şırınga düzeneğine geri çekin (Şekil 1: Adım 6).

Sonuçlar

Şekil 1: Deney düzeneğinin şematik gösterimi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ATCC 12600 Serisi	Amerikan Tipi kültür Koleksiyonu, VA, ABD
BacTiter-Glo Mikrobiyal Hücre Canlılığı Testi	Promega Şirketi, ABD	G8231 Serisi
BD Bacto Triptik Soya Suyu (Soya Fasulyesi-Kazein Sindirim Ortamı)	Becton-Dickinson, Amerika Birleşik Devletleri	BD 211825	Fisher Scientific, ABD'den satın alındı
BD Luer-Lok Şırınga steril, tek kullanımlık, 3 mL	BD, Amerika Birleşik Devletleri	309657
BD İğne 5/8 in. tek kullanımlık, steril, 25 g	BD, Amerika Birleşik Devletleri	305122
BD BBL Kurutulmuş Kültür Besiyeri: Mueller Hinton II Et Suyu (Katyon Ayarlı)	Becton-Dickinson, Amerika Birleşik Devletleri	B12322	Fisher Scientific, ABD'den satın alındı
BD Difco Kurutulmuş Kültür Ortamı: Triptik Soya Agar (Soya Fasulyesi-Kazein Digest Agar)	Becton-Dickinson, Amerika Birleşik Devletleri	DF0369-17-6	Fisher Scientific, ABD'den satın alındı
Gentamisin Sülfat	Fujian Fukang İlaç A.Ş., Fuzhou, Çin
LSE tezgah üstü sallama inkübatörü	Corning, NY, ABD
Plaka okuyucu (Synergy H1	Biotek, VT, ABD
Çalkalayıcı Innova 2100	New Brunswick Bilimsel, NJ, ABD
UHMWPE	GUR1020, Celanese, Teksas, ABD
Vankomisin Hidroklorür	Fagron, Hollanda	804148