Tek Hücreli Bakteri Büyümesinin Mikroakışkan Desenleme ve Floresan Tabanlı İzlenmesi

Bu makalede

Özet

Kaynak: Pioli, R., ve diğerleri, Sıralı Kılcallık Destekli Montaj Yoluyla Mikroorganizmaların ve Mikropartiküllerin Modellenmesi. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, karbonsuz bir süspansiyon ve kontrollü akış kullanarak mikroakışkan tuzaklarda tek floresan etiketli Escherichia coli (E. coli) hücrelerini yakalama yöntemini ve ardından mikrokolonilerin büyümesini ve floresan görüntülemesini tetiklemek için besin ilavesini göstermektedir.

Protokol

1. Bakteri desenlemesi

Deneyden bir gün önce, bir Escherichia coli popülasyonu büyütün (MG1655 prpsM-GFP suşu). Kültürü doğrudan donmuş stoktan aşılayın ve 37 °C'de bir çalkalayıcı inkübatörde lizojeni suyu (LB) ortamında 20 saat boyunca gece boyunca büyütün. Hücrelerin prpsM-GFP (yeşil floresan protein) plazmitini tutması için 50 μg/mL kanamisin ekleyin.
Deney gününde, başlamadan önce düzgün ve sabit bir sıcaklık sağlamak için kutu inkübatörü (Şekil 1A) deneyden birkaç saat önce 37 °C'ye ayarlayın. Ardından, şırınga pompasını ve ısıtılmış cam plakayı mikroskop aşamasına kurun (Şekil 1B, C), sıcaklığı kutu inkübatörü ile aynı sıcaklığa ayarlayın.
NOT: Mikroskop (Şekil 1E) dahil olmak üzere tüm sistemin içine yerleştirildiği kutu inkübatörü, kanal ortamla yıkandığında tüm deney boyunca düzgün ve sabit bir sıcaklığın korunmasını sağlar.
Deneyden doksan dakika önce, mikroakışkan çipi %100 etanol (EtOH) ile dolu bir kaba koyun ve kanalı en az 10 dakika boyunca %100 EtOH ile yıkayın. Mikroakışkan çipi vakumlu bir desikatöre yerleştirin ve en az 30 dakika boyunca gazdan arındırın. EtOH'yi damıtılmış suyla değiştirin ve çipi en az 30 dakika vakumla işlemden geçirin. Kanalda kalan sıvı izlerini gidermek için mikroakışkan çipi 70 °C'de 10 dakika fırına koyun.
NOT: Bu adım, kültür ortamı ile yıkandığında kanalda kabarcık oluşumunu önlemek için gereklidir.
Bir santrifüj şişesine 1 mL 3-(N-morfolino)propansülfonik asit (MOPS) ortamı (1x) pipetleyin ve 10 μL 0.132 M potasyum fosfat (K₂HPO₄ ) ekleyin. Gece kültürünü 37 ° C'lik inkübatörden çıkarın ve 100 μL'yi santrifüj şişesine alın ve kültürü 2.300 × g'da 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı santrifüj şişelerinden yavaşça pipetleyin ve peleti %0.015 v/v Tween 20 ve %0.01 v/v potasyum fosfat ile 1 mL taze MOPS ortamında yeniden süspanse edin.
NOT: Bakteri süspansiyonunun tipik konsantrasyonu, hacimce %0,015-0,15 aralığındadır, bu da genişletilmiş ve hareketli bir birikim bölgesinin oluşmasını sağlar ve substrat üzerinde partiküllerin birikmesini önler. Gece ortamının taze ortamla değiştirilmesi, şablon üzerinde bakteri filmlerinin salınması riskini en aza indirir. Taze ortamda bir karbon kaynağının olmaması, şablon desenleme sırasında hücrelerin süspansiyon içinde büyümesini engeller. PDMS şablonu üzerindeki çekilen sıvının temas açısının 30 ila 60° arasındaki optimum aralığa düşmesi için süspansiyonda %0,015 v/v Tween 20 konsantrasyonu gereklidir.
Bakteri süspansiyonunu 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin ve şırıngayı mikroakışkan boru aracılığıyla çipe bağlayın.
1. Şırınga ile boru arasındaki bağlantıyı sabitlemek için, dış çapı 0,6 mm olan bir iğneyi doğrudan borunun içine sokun. Giriş çevresinde kalan herhangi bir süspansiyonun kanal boyunca dağılmasını önlemek için, taze ortamı giriş olarak kullanılan delik yerine desenleme işlemi sırasında çıkış olarak kullanılan delikten (Şekil 2A-III) yıkayın.
2. Şırıngayı şırınga pompasına monte edin ve süspansiyon, şablon bölgesini tuzaklarla kaplayana kadar kanalın yukarı akış kısmında bulunan girişten süspansiyonu mikroakışkan çipe enjekte edin. NOT: Sıvı enjeksiyon işlemi sırasında hava, kanalın aşağı akış ucunda bulunan bir çıkıştan kaçabilir.
3. Şırınga pompasını, tarif edilen geometride 80-100 μm/dak'lık bir menisküs geri çekilme hızına karşılık gelen 0.07-0.2 μL/dak'lık bir akış hızında bakteri süspansiyonunu (Şekil 2A-I) geri çekecek şekilde ayarlayın.
4. Mikroskop yazılımı ile desenleme sürecini izleyin.
  NOT: Burada, şablon üzerinde uzaklaşan menisküsü izlemek için 10x büyütme kullanıldı ve tek tek bakterilerin mikrofabrikasyon tuzaklara birikmesini izlemek için 20x büyütme kullanıldı.
Şablon hücrelerle modellendikten sonra (Şekil 2A-II), mikroakışkan kanalı hızlı bir şekilde boşaltmak için geri çekme akış hızını artırın ve daha önce en az 30 dakika boyunca gazdan arındırılmış ve 30 °C'de önceden ısıtılmış taze LB ile yıkayın.
Kanalı nazikçe yıkamak için şırınga pompasını 2 μL/dak akış hızına ayarlayın. Kanal doldurulduktan sonra, özel deneysel ihtiyaçlara göre akış hızını (15 μL/dak) artırın.
İstenilen büyütme ve zaman aralığında büyüyen bakterilerin görüntülerini elde edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1: Mikroakışkan bir kanalda sıralı kılcallık destekli montaj için platformun şeması. (A) Kutu inkübatörü. Kutu inkübatörü, mikroakışkan kanal içinde düzgün ve sabit bir sıcaklık (burada 30 °C) sağlar. (B) Sıvı süspansiyon yüklü şırınga...