Anaerobik Koşullar Altında Biyoyararlı Cıvayı Tespit Etmek için Bakteriyel Biyosensör Testi

Özet

Kaynak: Stenzler, BR ve diğerleri, Cıva ve Kadmiyumun Tespiti için Anaerobik Biyosensör Testi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, anaerobik koşullar altında cıva iyonlarının biyolojik olarak kullanılabilir fraksiyonunu doğru bir şekilde ölçmek için genetiği değiştirilmiş bakteriyel biyosensörlerin kullanımını göstermektedir. Test, magnezyum sülfat konsantrasyonunu değiştirerek, floresan yoğunluğundaki değişikliklerle gösterildiği gibi, biyosensörün serbest cıva iyonlarına seçici olarak yanıt vermesini sağlar.

Protokol

1. Maruz Kalma Testi

1. Plaka düzeni tasarlama.
   NOT: Maruz kalma testine başlamadan önce tüm pipetleme değerlerinin hesaplandığından ve stokların hazırlandığından emin olun.Bir deneyin nasıl düzgün bir şekilde tasarlanacağı ve hangi kontrollerin dahil edileceği metinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Ayrıca anaerobik monitörde gösterilen anaerobik odada oksijen varsa deney başlatılmamalıdır.
2. Plaka düzenini 96 oyuklu bir şablona göre tasarlayın. Bu, şişeleri ayarlamak için en iyi 4 x 8'lik bir ızgara ile temsil edilen 3'ün teknik kopyalarında deneyler yapmak için 32 farklı işleme izin verecektir (bkz. Şekil 1).

NOT: Cıva ile indüklenebilir biyosensör ile bir değişkenin Hg alımı üzerindeki rolünü test ederken, her değişken için iki işlem gereklidir: tedavi (biyosensör + cıva (Hg) + değişken + nitrat) ve boş tedavisi (biyosensör + değişken + nitrat). Kurucu biyosensör kullanılarak bir değişkenin hücrenin fizyolojisi üzerindeki rolünü test ederken, her değişken için iki tedavi gereklidir: tedavi (biyosensör + Hg + değişken + nitrat) ve boş tedavi ( biyosensör + değişken + Hg). Cıva, kadmiyum (Cd) ile değiştirilebilir. Bir kalibrasyon eğrisi gerçekleştirirken Hg veya Cd değişken olacaktır. Kurucu ve indüklenebilir biyosensörlerin aynı anda (aynı plaka düzeninde) çalıştırılmasına gerek yoktur. Bir magnezyum konsantrasyon aralığını (değişken) test ederken plaka düzeni ve karşılık gelen 4 x 8 ızgara için bir şablon örneği Tablo 1'de verilmiştir.

2. 4 x 8 ızgarayı tahlil plakası düzenine göre ayarlayın.

1. Tepsiye 7 mL politetrafloroetilen (PTFE) standart şişeleri yerleştirin.
NOT: PTFE şişeleri kullanımdan önce asitle yıkanmalı veya ısıyla sterilize edilmelidir. Sadece şişenin dışını manipüle ederek ele alınmalıdırlar.

2. Her şişeye, her tedaviye karşılık gelen maruz kalma ortamı hacmini ekleyin.
NOT: Toplam hacmi 2.000 μL (2 mL) olan bir maruziyette, eklenen pozlama ortamı şöyle olacaktır: pozlama ortamı μL = 2.000 μL – tedavi (boş) μL. (örneğin, pozlama ortamı μL = 2.000 – 100 μL (biyosensör) – 40 μL (nitrat) – 100 μL (Hg) – 100 μL (değişken (örn. magnezyum sülfat, MgSO₄)) = 1660 μL). Test edilen değişkene eklenen hacmin nihai hacmin %5'ini (100 μL) aşmadığından emin olun.

3. Test edilecek kimyasal değişkenin çözeltisinin karşılık gelen hacmini, plaka düzenine göre her şişeye ekleyin.

4. Nihai konsantrasyon 200 μM (40-80 μL) olacak şekilde her şişeye nitrat ekleyin. Yapısal biyosensör işleme boşlukları için bu adımı hariç tutun.

5. Plaka düzenine göre şişelere Hg (bir değişkeni test ederken 5 nM ) veya Cd (bir değişkeni test ederken 300 nM ) ekleyin. Cıva ile indüklenebilir biyosensör tedavi boşlukları için bu adımı hariç tutun.

1. Hg kullanırken 4-8 μM'lik stoğu alın ve iyice çalkalayın. Çalışan bir Hg çözeltisi yapmak için çözeltiyi 7 mL'lik bir PTFE şişesinde maruz kalma ortamında 100-250 nM'ye seyreltin. Bu çalışma solüsyonundan gerekli şişelere Hg ekleyin. Bu durumda, 0 ila 12,5 nM arasında değişen Hg'lik bir kalibrasyon eğrisi.
NOT: Bir değişkenin Hg veya Cd biyoyararlanımı üzerindeki etkisini test ederken, [Hg] veya [Cd]'nin tüm tedavilerde sabit kaldığından emin olun. Hg veya Cd eklerken, bir pipet ucu kullandığınızdan emin olun, ancak şişelerdeki pozlama ortamına asla dokunmayın.

Yörünge hareketiyle manuel olarak sallayın.
NOT: Hg veya Cd'nin çözeltide türleşmesi için gereken süreye bağlı olarak deney şimdi duraklatılabilir. Bir saatten fazla bırakılırsa, buharlaşmayı/kontaminasyonu önlemek için PTFE şişelerinin üzerine PTFE kapakları yerleştirin.

Homojenliği sağlamak için Biyosensör Stokunu yavaşça ileri geri pipetleyin. Her şişeye 100 μL Biyosensör Stoğu ekleyin. Yörüngesel olarak manuel olarak sallayın.

Plaka okuyucuyu aşağıdaki kriterlere göre okumak için ısınmaya hazırlayın: 37°C'de sıcaklık, okumalar arasında yörünge sallama ile her 2,5-5 dakikada bir okuma ile 10 saat kinetik çalışma ve 440 nm floresan uyarımı ve 500 nm emisyon ile floresan ölçümleri.

4 x 8 ızgaradaki her bir PTFE şişesinden 200 μL'yi 96 oyuklu plakanın (Siyah, 96 Kuyulu Şeffaf Tabanlı Bağlayıcı Olmayan Yüzey Mikroplakaları) karşılık gelen kuyucuklarına pipetleyin. Her 200 μL'yi aktarmadan önce beş kez ileri geri pipet takın.NOT: Pipet ucunu atmak yerine, pipetleme ilerlemesini takip etmek için pipet ucunu PTFE şişesinde bırakın.

96 oyuklu plakayı plaka okuyucunun tepsisine yerleştirin, ardından kapağı 96 oyuklu plakanın üzerine yerleştirin ve tahlillere başlayın.

 

Tablo 1: Bir Magnezyum gradyanı (0-10 mM) üzerinde Hg biyoyararlanımını (5 nM) test etmek için biyosensörün kullanılmasına yönelik örnek bir plaka düzeni

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

a

Hg kaynaklı biyosensör + Hg + Nitrat + 0 mM Mg

Hg kaynaklı biyosensör + Nitrat + 0 mM Mg

Yapısal biyosensör + Hg + Nitrat + 0 mM Mg

Yapısal biyosensör + Hg + 0 mM Mg

b

Hg kaynaklı biyosensör + Hg + Nitrat + 0.1 mM Mg

Hg kaynaklı biyosensör + Nitrat + 0,1 mM Mg

Yapısal biyosensör + Hg + Nitrat + 0.1 mM Mg

Yapısal biyosensör + Hg + 0,1 mM Mg

c

Hg kaynaklı biyosensör + Hg + Nitrat + 1 mM Mg

Hg kaynaklı biyosensör + Nitrat + 1 mM Mg

Yapısal biyosensör + Hg + Nitrat + 1 mM Mg

Yapısal biyosensör + Hg + 1 mM Mg

d

Hg kaynaklı biyosensör + Hg + Nitrat + 10 mM Mg

Hg kaynaklı biyosensör + Nitrat + 10 mM Mg

Yapısal biyosensör + Hg + Nitrat + 10 mM Mg

Yapısal biyosensör + Hg + 10 mM Mg

Malzemeler