Kolorimetrik Bir Test Kullanılarak Bakteriyel Membrana Bağlı Pirofosfataz İnhibitörlerinin Taranması

Özet

Kaynak: Vidilaseris, K., ve diğerleri. Thermotoga maritima Membrana Bağlı Pirofosfataz İnhibitörlerinin taranması. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, ortofosfat salınımını ölçerek bakteriyel membrana bağlı pirofosfataz (mPPaz) inhibitörlerini taramak için kolorimetrik bir tahlil göstermektedir. Yöntem, potansiyel bir antimikrobiyal ilaç hedefi olan Thermotoga maritima'dan mPPaz'ı inhibe eden bileşiklerin tanımlanmasını sağlar.

Protokol

1. Tahlil hazırlama için reaktifler

1. Arsenit-sitrat çözeltisini hazırlayın.
   1. 5 g sodyum arsenit ve 5 g trisodyum sitrat dihidrat tartın.
      DİKKAT: Sodyum arsenit zehirlidir; bu nedenle uygun koruyucu ekipman kullanın ve özel bir dikkatle kullanın. Önlem olarak, gerekli tüm güvenlik önlemleri okunup anlaşılmadan elleçlemeyin. Bileşiğin veya çözeltinin/çözeltilerinin tozunu/buharlarını solumamak için yalnızca çeker ocakta tutun. Solunması halinde temiz havaya çıkın ve tıbbi yardım alın. Yutmayı ve göz/cilt temasını önlemek için uygun kimyasal koruyucu gözlük, koruyucu eldiven ve giysi kullanın. Yutulması halinde derhal bir zehir merkezini veya doktoru/hekimi arayın. Cilde veya göz(ler)e bulaşırsa, bol su ile yıkayın ve tıbbi yardım alın.
   2. 100 mL suda eritin.
   3. 5 mL buzlu asetik asit ekleyin, karıştırın ve 250 mL'ye su ekleyin.
   4. Oda sıcaklığında, ışıktan koruyarak saklayın.
      NOT: Çözüm bir yıldan fazla bir süredir stabildir.
2. Çözelti A ve çözelti B'yi hazırlayın.
   1. Çözelti A için, 0,3 g askorbik aside 10 mL buz gibi soğuk 0,5 M HCl (hidroklorik asit) ekleyin. Askorbik asidi vorteksleyerek çözün.
   2. B çözeltisi için, çözünmesi için 70 mg amonyum heptamolibdat tetrahidrat ve vortekse 1 mL buz gibi soğuk su ekleyin.
      NOT: Her iki çözeltiyi de kullanana kadar buz üzerinde saklayın. Test sonucunun tutarlılığı için, her iki çözelti de buz üzerinde en fazla bir hafta saklanabilir.
3. Kalibrasyon için fosfat (Pi) standardını 0 μM, 62.5 μM, 250 μM ve 500 μM konsantrasyonunda hazırlayın.
   1. 370 μL reaksiyon karışımı içeren dört mikrotüpe 0 μL, 25 μL, 50 μL ve 100 μL 5 mM Na₂HPO₄ (disodyum fosfat) dihidrat ekleyin.
   2. 1 mL'ye kadar su ekleyin.

2. Bir adet 96 oyuklu plaka için aktivite testi

NOT: Testin şematik iş akışı için Şekil 1'e bakın.

1. 10 mL A çözeltisine 1 mL B çözeltisi ekleyin, vorteksleyerek karıştırın ve çözeltiyi buz üzerinde saklayın.
   NOT: Bu çözelti şeffaf ve sarı olmalıdır. Kullanmadan önce A + B solüsyonunu en az 30 dakika buz üzerinde tutun. Ancak, uzun süreli depolamadan sonra bozulacağı için solüsyonu 3 saat içinde kullanın.
2. Çok kanallı bir pipet kullanarak tüp şeritlerine üç kopya halinde 40 μL 0 μM, 62.5 μM, 250 μM ve 500 μM Pi standardı ekleyin.
   NOT: Pi eklenmemiş reaksiyon karışımı boş olarak kullanılacaktır.
3. Çok kanallı bir pipet kullanarak tüp şeritlerine 25 μL bileşik çözelti ekleyin.
   NOT: Her bileşiğin üç farklı konsantrasyonu vardır, bu da yarı maksimal inhibitör konsantrasyonun (IC50) ilk tahmini için yeterlidir. Daha doğru bir IC50 tayini için sekiz farklı bileşik konsantrasyonu kullanılabilir. İnhibe edilmemiş enzim için bileşik çözelti eşit miktarda su ile değiştirilir. Pozitif kontrol olarak 2.5 μM, 25 μM ve 250 μM imidodifosfat (IDP) sodyum tuzu kullanıldı.
4. Çok kanallı bir pipet kullanarak tüp şeritlerine (Pi standardı içeren tüpler hariç) 15 μL mPPase (membrana bağlı pirofosfataz) çözelti karışımı ekleyin.
5. Tüp şeritlerini yapışkan bir sızdırmazlık tabakası ile kapatın. Her bir boru şeridini ayırmak için sızdırmazlık tabakasını kesin.
6. Numuneleri 71 °C'de 5 dakika önceden inkübe edin. Sonraki adımlarda zaman tüketimini en aza indirmek için numuneleri her şerit arasında 20 saniye aralıklarla ısıtma bloğuna yerleştirin.
7. Her şerit için yapışkan contayı açın. Çok kanallı bir pipet kullanarak 10 μL 2 mM sodyum pirofosfat dibazik ekleyin ve 5× boyunca yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Aynı sızdırmazlığı kullanarak boru şeridini tekrar kapatın.
   NOT: Bu adımın başlangıçta 20 saniyede gerçekleştirilmesi zor olabilir; ancak bazı tahlillerden sonra daha kolay hale gelecektir.
8. 71 °C'de 5 dakika inkübe edin.
9. Numuneleri her şerit arasında 20 saniye aralıklarla soğutma aparatına yerleştirin. 10 dakika soğumalarını bekleyin, ancak 5 dakika soğuduktan sonra her şeridi kısa bir süre santrifüjleyin, sızdırmazlık tabakasının altındaki su damlalarını boşaltın, ardından soğutma aparatına geri koyun ve sızdırmazlığı çıkarın.
   NOT: Soğutma aparatı, suyla doldurulmuş ve en az 1 saat dondurulmuş bir polistiren Petri kabına (150 mm × 15 mm boyutunda) 96 oyuklu bir PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) plakası yerleştirilerek kolayca yapılabilir. Cihaz, testin başlamasından yaklaşık 5 dakika önce dondurucudan çıkarılmalıdır. Reaksiyon karışımını donduracağı ve renk gelişimini engelleyeceği için numune soğutmadan hemen önce soğutma aparatını çıkarmayın.
10. 10 dakika soğuduktan sonra 60 μL A + B solüsyonu ekleyin, 5× yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve tüp şeritlerini 10 dakika soğutma aparatı üzerinde tutun.
11. 90 μL arsenit-sitrat çözeltisi ekleyin ve sabit bir mavi renk elde etmek için oda sıcaklığında en az 30 dakika tutun.
    DİKKAT: Toksisitesi nedeniyle, sodyum arsenit içeren tüm çözeltiler her zaman ekstra dikkatle kullanılmalıdır. Bu nedenle arsenit-sitrat çözeltisinin eklenmesi çeker ocakta yapılmalıdır.
12. Her reaksiyon karışımının 180 μL'sini berrak 96 oyuklu bir polistiren mikroplakaya dağıtın.
13. Bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak her bir kuyucuğun absorbansını 860 nm'de ölçün.

Sonuçlar

Şekil 1: 96 oyuklu plaka formatında TmPPase inhibisyon testinin şematik iş akışı. Kırmızı numaralandırma, protokole göre testin adımlarını, mavi oklar ise aralık sırasını gösterir. TmPPase: Termofilik bakteri Thermotoga maritima'dan m...

Malzemeler