Bakteri Sporlarının İç Zarındaki Çimlenme Proteinlerinin Görselleştirilmesi

Özet

Kaynak: Wen, J., Pasman, vd. al., Bacillus subtilis Sporlarında Mikropların ve İç Zarın Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, bakteri sporu içindeki çimlenme proteinlerinin organizasyonunu ortaya çıkaran üç boyutlu floresan görüntüleri elde etmek için yapılandırılmış aydınlatma mikroskobunun kullanımını göstermektedir.

Protokol

1. Çimlenme Proteini Görüntüleme (Zamanlama: 1 saat)
   1. 100x yağ objektifi (Sayısal Açıklık = 1.49), bir CCD (Şarj Bağlantılı Cihaz) kamera ve görüntü analiz yazılımı ile donatılmış bir Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu ( Malzeme Tablosuna bakınız) üzerinde sporların iletim ve floresan görüntülerinin yanı sıra kırmızı ve sarı-yeşil karboksilat ile modifiye edilmiş floresan mikrokürelerin bir karışımını yakalayın (bkz.). Tüm görüntüleri ortam ışığını bozmadan oda sıcaklığında oluşturun. Görüntülemeden önce 100x objektifi ve slaytı her zaman %75 etanol ile temizlediğinizden emin olun.
   2. 100 nm (çap) floresan mikrokürelere odaklanın ve simetrik bir psf elde edilene kadar 100x objektif üzerindeki düzeltme halkasını ayarlayarak nokta yayılma işlevini (psf) optimize edin, böylece görüntünün bulanıklığını en aza indirin. psf, bir görüntüleme sisteminin bir nokta kaynağa veya nokta nesneye verdiği dürtü yanıtı veya yanıtıdır.
   3. Yaklaşık 10 yuvarlak floresan mikroküre içeren bir görüş alanı seçin. Görüntü analiz yazılımı için kılavuz olarak hem 561 nm hem de 488 nm uyarma dalga boyları için bir ızgara odak ayarı uygulayın.
   4. Sporları iletim ışığıyla odaklayın ve her görüntü için 200 ms pozlama ile ortalama 16× modunda bir iletim ışığı görüntüsü yakalayın.
   5. "3D-SIM" aydınlatma modu, Elektron Çarpma (EM) Kazancı 14 bit'te 10 MHz ve 175'te EM kazancı okuma moduna ayarlanan kamera ayarları ile sporların 3D-SIM ham floresan görüntülerini yakalayın. FM4-64 probunu PS4150 sporlarında %20 lazer gücünde 561 nm lazer ışığı ve 400 ms aydınlatma süresiyle heyecanlandırın.
   6. KGB80 sporlarındaki GerKB-mCherry ve GerD-GFP'yi sırasıyla 1 saniye boyunca %30 lazer gücünde 561 nm lazer ışığı ve 3 saniye boyunca %60 lazer gücünde 488 nm lazer ışığı ile uyarın. Z-Stack ayarları yukarıdan aşağıya modda, 0.2 μm/adım.
      NOT: Bu lazer parametreleri, histogram penceresi için yaklaşık 4.000 maksimum parlaklık değeri sağlamak için uygulandı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Havayla kurutulmuş cam slaytlar	Menzel Gläser	630-2870
APO TIRF N20R8 ×100 yağ hedefi (NA=1.49)
Bacillus subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mKiraz kedisi, gerD-gfp kan)
Bacillus subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
FluoSpheres karboksilat ile modifiye edilmiş mikroküreler	Titreşim, 0,1 μm	F8803 Serisi
FM4-64 Serisi	Thermo Fisher Bilimsel	F34653 Serisi
Histodenz iyonik olmayan yoğunluk gradyan ortamı	Sigma-Aldrich	D2158 Serisi
Resim J
iXON3 DU-897 X-6515 CCD kamera	Andor Teknolojisi		https://imagej.net/Welcome
Mikroskop görüntüleme yazılımı	Nikon, Japonya	NIS-Eleman AR 4.51.01
MilliQ Ultra Saf Deminerilize Su	Kırlangıç	Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti mikroskop
Hassas Lameller	Paul Marienfeld'in fotoğrafı.	117650
Vidalı kapaklı tüpler 50 mL	Thermo Fisher Bilimsel		Nunc TM