Vahşi Tip Amiplerin Bakteriyel Besleme Desteği ile Elektroporasyon Yoluyla Transfeksiyonu

Özet

Kaynak: Paschke, P., ve diğerleri. Bakteriler Üzerinde Seçim ve Büyümeye Dayalı Dictyostelium discoideum Hücrelerinin Genetik Mühendisliği. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, bir hedef gen taşıyan bir plazmidin elektroporasyon yoluyla amip hücrelerine sokulması ve ardından vahşi tip amiplerde verimli gen iletimini sağlamak için bir bakteri takviyesinde geri kazanım prosedürünü göstermektedir.

Protokol

1. Transfeksiyon için Dictyostelium hücrelerinin ayarlanması
   1. Klebsiella aerogenes'i SM (Yağsız süt) ortamında (besin açısından zengin ortam) gece boyunca RT'de (Oda sıcaklığında) birleşecek şekilde büyütün. Kültürler 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
   2. Bu bakteri süspansiyonunun yaklaşık 400 μL'sini bir SM agar plakasına ekleyin (pepton 10 g/L; maya özütü 1 g/L; glikoz 10 g/L; KH₂PO₄ 1,9 g/L; K₂HPO₄ x 3 H₂O, 1,3 g/L; MgSO₄ susuz 0,49 g/L; %1.7 agar) ve eşit olarak yayılır. Steril bir döngü alın ve Dictyostelium hücreleri ile aşılayın. Hücreleri plakanın bir kenarına yayın.
   3. Transfeksiyon için yeterince büyük büyüme bölgeleri sağlamak için plakayı 22 °C'de 2 gün inkübe edin.
      NOT: Büyük büyüme bölgeleri oluşturmayan Dictyostelium suşları (örneğin, Ax3, DH1 veya JH10) veya deneyimsiz deneyciler için bunun yerine temizleme plakaları kullanın.
   4. Steril bir halka alın ve Dictyostelium hücreleri (yaklaşık 2-4 x 10⁵ hücre) ile aşılayın. Hücreleri SM'de 800 μL'lik yoğun bir K. aerogenes süspansiyonuna aktarın. Hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
   5. Taze SM agar plakalarına 400 μL, 200 μL, 100 μL ve 50 μL aktarın. Her plakaya 400 μL ilave SM K. aerogenes süspansiyonu ekleyin, eşit şekilde yayın ve kurutun.
   6. Plakalar yarı saydam hale gelene kadar plakaları 22 °C'de yaklaşık 2 gün inkübe edin.
      NOT: Daha hızlı büyüme hızları nedeniyle, bakteriler başlangıçta birleşik bir çim üretir ve amipler daha sonra bakteri plakasını "temizler". Bu işlem için gereken süre, suş arka planına ve mutant hücrelerin bakteriler üzerinde büyüme yeteneğine bağlı olarak değişebilir.

2. Bakteri Seçimine Dayalı Dictyostelium Hücrelerinin Transfeksiyonu

1. K. aerogenes süspansiyonlu plakalar hazırlamak için, 10 cm'lik bir doku kültürü ile işlenmiş petri kabına OD (Optik yoğunluk)₆₀₀ = 2 yoğunluğa kadar K. aerogenes bakterileri içeren 10 mL SorMC tamponu ekleyin (istenen bakteri konsantrasyonu için hazırlanan OD₆₀₀ = 100 K. aerogenes stok çözeltisinden 200 μL ekleyin).
   NOT: Bu plakaya daha sonra transfekte edilmiş D. discoideum hücrelerini yetiştirmek için ihtiyaç duyulur. Alternatif olarak, 6 oyuklu bir doku kültürü plakası kullanılabilir. Ekstrakromozomal plazmitlerin transfeksiyonu durumunda, 6 oyuklu doku kültürü plakası kaynak açısından daha verimlidir. Kuyu başına 2 mL K. aerogenes SorMC (OD₆₀₀ = 2) süspansiyonu kullanın.
2. Dictyostelium hücrelerinin hazırlanması
   1. 10 μL'lik tek kullanımlık bir aşılama döngüsü kullanarak, kültür plakasının (temizlenmiş alanın kenarı) veya temizleme plakasının büyüme bölgelerinden (yaklaşık 3 cm) hücreleri kazıyın. Hücreleri 1 mL buz gibi H40 tamponu içeren 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
      NOT: Temizleme plakalarından hücrelerin toplanmasının zamanlaması çok önemlidir. Çok erken hasat çok az miktarda hücre verirken, geç hasat kısmen gelişmiş hücrelerin verim alma riskini artırır.
   2. Hücreleri 1.000 x g'da 2 dakika döndürerek veya 10.000 x g'da 2 saniye boyunca hızlı döndürerek yıkayın. Süpernatanı atın ve H40 tamponundaki hücreleri 2-4 x 10⁷ hücre/mL'lik bir nihai yoğunluğa kadar yeniden süspanse edin. Tüm transfeksiyon prosedürü boyunca hücreleri soğuk tutun. Tüplerin ve buzun doğrudan temasını sağlamak için buzlu su bulamacı kullanın.
3. Elektroporasyon
   1. 1-2 μg DNA (Deoksiribonükleik asit) içeren bir tüpe 100 μL hücre ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek dikkatlice karıştırın.
   2. Hücre/DNA karışımını önceden soğutulmuş bir elektroporasyon küvetine (2 mm boşluk) aktarın.
   3. Aşağıdaki kare dalga ayarlarını kullanarak hücreleri vurun: 350 V, 8 ms, 2 darbe ve 1 s darbe aralığı.
      NOT: 2 μg'dan fazla DNA eklemeyin. Daha yüksek miktarlar hücreler için toksiktir ve transfeksiyon verimliliğini azaltır. Eklenen toplam DNA hacmi 5 μL'yi geçmemelidir.
   4. Hücreleri hemen önceden hazırlanmış 10 cm'lik Petri kabına K . aerogenes SorMC ile aktarın ve hücrelerin 5 saat boyunca iyileşmesine izin verin.
      NOT: Petri kabındaki hücreleri ters mikroskop altında kontrol edin. Hücreler elektroporasyondan hemen sonra yuvarlak görünecek, ancak yüzeye düzgün bir şekilde yapışmak için yeterli zamana sahip olduklarında yaklaşık 30 dakika sonra amipoid şekillerine geri döneceklerdir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Eppendorf Mikrosantrifüjler 5424/5424R	Termo Bilimsel	05-400-002
Eppendorf 5702R A-4-38 Model Rotorlu Santrifüjler	Termo Bilimsel	12823252
Güvenlik Kabini Foruna - SCANLAF	Labojen
Biyofotometre Artı	Eppendorf Belediyesi
CLSM 710 Standardı	Zeiss
Saflaştırılmış Agar	Oksoid	LP0028 Serisi
SM et suyu	Orta için	SMB0102
2x LB et suyu	Orta için	LBD0102
HEPES serbest asit	Sigma Aldrich/Merck	391340 EMD
KH₂PO₄	VWR	P/4800/53
Na₂HPO₄ 2H₂O	VWR	10028-24-7
MgCl₂ 6H₂O	Sigma Aldrich/Merck	5982 EMD
CaCl₂ 2H₂O	Sigma Aldrich	442909
Folik asit	Sigma Aldrich	F7876 Serisi
KOH	VWR	26668.263
100 x 20 mm stil Doku Kültürü Kabı, Doku Kültürü Tedavisi Görmüş	Corning Anonim Şirketi	353003
2 mm aralıklı elektroporasyon küvetleri, uzun elektrot	Geneflow Sınırlı	E6-0062
10 μl Aşılama Döngüsü, Mavi 10 Mikro L	Termo Bilimsel	129399
Yayıcı, L şeklinde, steril	Greiner Biyo-Bir	730190