İyonik Olmayan Deterjan Faz Ayrımı Kullanılarak Bakteriyel Lipoproteinlerin Zenginleştirilmesi

Özet

Kaynak: Armbruster, K.M., Meredith, T.C. Bakteriyel Lipoproteinlerin Zenginleştirilmesi ve Kütle Spektrometresi ile Yapısal Belirleme için N-terminal Lipopeptitlerin Hazırlanması. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, ısıtıldığında faz ayrımına uğrayan iyonik olmayan bir deterjan kullanılarak bakteriyel lipoproteinlerin zenginleştirilmesini göstermektedir. Sıralı sıcaklık değişimleri ve santrifüjleme adımları yoluyla, lipoproteinler seçici olarak deterjan fazına bölünürken, lipoprotein olmayan kirleticiler uzaklaştırılır. Zenginleştirilmiş lipoproteinler daha sonra çökeltilir, yıkanır ve sonraki uygulamalar için yeniden süspanse edilir.

Protokol

1. Triton X-114 (TX-114) Faz Bölümlemesi ile Lipoproteinlerin Zenginleştirilmesi

1. Buz gibi soğuk Tris tamponlu salin/Etilendiamintetraasetik asit (TBSE) içinde eşit hacimde %4 (hacim/hacim) yüzey aktif madde ekleyerek bakteri lizatını TX-114 yüzey aktif madde ile %2'lik (hacim/hacim) bir nihai konsantrasyona kadar tamamlayın ve buz üzerinde 1 saat inkübe edin, her ~15 dakikada bir ters çevirerek karıştırın.
   NOT: Soğutulduğunda, süpernatan ve yüzey aktif madde karışabilir.
2. Tüpü 37 °C'lik bir su banyosuna aktarın ve faz ayrılmasını sağlamak için 10 dakika inkübe edin. İki fazlı ayırmayı sürdürmek için numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
3. Üst sulu fazı yavaşça pipetleyin ve atın. Tüpü orijinal hacmine kadar yeniden doldurmak için alt yüzey aktif madde fazına buz gibi soğuk TBSE ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
4. Tüpü 37 °C'lik bir su banyosuna aktarın ve faz ayrılmasını sağlamak için 10 dakika inkübe edin, ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
5. Toplam 3 ayrım için 1.3-1.4 arasındaki adımları bir kez daha tekrarlayın. Üst sulu fazı çıkarın ve atın.
6. Yüzey aktif madde fazına 1 hacim buz gibi soğuk TBSE ekleyerek, ekstraksiyonlar sırasında oluşan çökeltilmiş protein peletini (tüpün dibinde görülebilir) çıkarın. Çözünmeyen proteini pelet haline getirmek için 4 °C'de 16.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
   NOT: Numune tek fazlı kalmalıdır. Faz ayrımı meydana gelirse, numuneyi yeniden soğutun ve tekrar santrifüjleyin. Pelet genellikle lipoprotein olmayan kirleticilerden oluşur ancak daha ileri analizler için saklanabilir.
7. Süpernatanı hemen 1250 μL %100 aseton içeren yeni bir 2.0 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Viskoz olacağından numuneyi uçtan yıkamak için yukarı ve aşağı iyice pipetleyin. Ters çevirerek karıştırın ve proteini çökeltmek için gece boyunca -20 °C'de inkübe edin.
8. Tüpün yönüne dikkat ederek lipoproteinleri pelet etmek için numuneyi oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. Lipoproteinler, tüpün dış duvarı boyunca ince, beyaz bir film oluşturacaktır.
9. Peletleri iki kez %100 asetonla yıkayın. Asetonu boşaltın ve numunenin kurumasını bekleyin.
10. 20-40 μL 10 mM Tris-hidroklorür, pH 8.0 veya standart bir Laemmli SDS-PAGE numune tamponu ekleyin ve çökeltilmiş lipoproteinlerle duvara karşı yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice yeniden süspanse edin. Lipoproteinleri yerinden çıkarmak için tüpün kenarını pipet ucuyla kazıyın.
    NOT: Lipoproteinler Tris tamponunda çözünmeyecek, bunun yerine bir süspansiyon oluşturacaktır.
    1. Lipoproteinleri kullanana kadar -20 °C'de saklayın.

Malzemeler