İnsan Norovirüsünün Bakteri Kaynaklı Rekombinant P Alanı Proteinlerinin Saflaştırılması

Özet

Kaynak: Leuthold, M.M., ve diğerleri. X-ışını Kristalografisi için E. coli'de İnsan Norovirüs Çıkıntılı Alanlarının Üretimi. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak rekombinant insan norovirüs P alanının saflaştırılmasını gösterir ve hedef proteinin diferansiyel gözenek erişilebilirliğine dayalı olarak daha yüksek ve daha düşük moleküler ağırlıklı safsızlıklardan ayrılmasını vurgular. Proses, UV absorbansı ile izlenir ve ayrıştırılan fraksiyonların SDS-PAGE analizi ile doğrulanır.

Protokol

1. 3. Arıtma Adımı

1. HPLC (Yüksek performanslı sıvı kromatografisi) arıtma sisteminin pompalarını ve borularını yıkayın ve SEC (Boyut dışlama kromatografisi) kolonunu (Malzeme Listesine bakın) GFB (Jel filtrasyon tamponu) ile önceden dengeleyin.
2. Konsantre numunenin hacmine bağlı olarak bir süper döngü (12 ml'ye kadar) veya döngü (3 ml'ye kadar) kullanarak P alanını kolona 1 ml/dak akış hızında enjekte edin. Enjeksiyon bittikten sonra akış hızını 2,5 ml/dk'ya yükseltin.
3. OD (optik yoğunluk) arttıkça ve P alanı kolondan çıktıkça, 1,5 ml'lik fraksiyonları toplayın. %12'lik bir jel ile SDS-PAGE kullanarak fraksiyonları kontrol edin (Şekil 1A ve 1B). Yalnızca en saf fraksiyonları bir araya toplayın ve ~ 3 mg/ml ve ~ 8 mg/ml'ye konsantre edin.
   Not: ~110 ml'den (boş hacim) sonra, çoğu safsızlık 320 ml yatak hacmine sahip bir SEC kolonundan ayrıştırılır. P alanı genellikle bir dimer olarak ayrıştırılır. P alan dimerinin elüsyon süresi/hacmi, SEC kolonunun hazırlık derecesine (pg) bağlıdır.

Sonuçlar

Şekil 1. 3. saflaştırma adımı için şematik ve temsili sonuçlar.
SEC ve karşılık gelen SDS-PAGE sonucu kullanılarak P alanı elüsyonunun kromatogramı. Siyah sayılar toplanan kesirleri gösterir. A) SEC sütunundaki ayrımın şe...

Malzemeler