Negatif İyon Değişim Kromatografisi ile Bir Bakteriyel Proteinin Seçici Saflaştırılması

Özet

Kaynak: Kuo, T., ve diğerleri. Helicobacter pylori Nötrofil Aktive Edici Proteinin Toplu Modda Escherichia coli'de Aşırı Eksprese Edilmesinin Tek Adımlı Negatif Kromatografik Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2016)

Video, virülansla ilişkili bir proteini bir bakteri lizatından saflaştırmak için bir negatif kromatografi tekniğini göstermektedir. Tamponlu bir çözeltide pozitif yüklü bir reçine kullanılarak, konakçı hücre proteinleri seçici olarak tutulurken, nötre yakın hedef protein bağlanmadan kalır ve akışta toplanır. Bu yöntem, sonraki uygulamalar için hedef proteinin verimli bir şekilde ayrılmasına ve geri kazanılmasına izin verir.

Protokol

1. Escherichia coli'de (E. coli) Rekombinant HP-NAP İfadesi

1. Daha önce tarif edildiği gibi H. pylori 26695 suşundan Helicobacter pylori nötrofil aktive edici proteinin (HP-NAP) DNA dizisini içeren plazmit pET42a-NAP'yi hazırlayın. HP-NAP'ın DNA dizisini içeren plazmitleri istenen nokta mutasyonları ile hazırlayın.
2. Yukarıdaki DNA plazmitlerinin 10 ng'sini 42 °C'de 45 saniye boyunca ısı şoku ile E. coli BL21 (DE3) yetkin hücrelere dönüştürün, hücreleri 50 μg/ml kanamisin içeren lizojeni suyu (LB) agar plakaları üzerinde çizin ve plakaları 37 °C'de 16 saat inkübe edin.
3. Tek kolonileri 50 μg/ml kanamisin ile 5 ml LB suyu içeren ayrı tüplere aşılayın ve 170 rpm'de çalkalayarak 16 saat boyunca 37 °C'de ön kültür olarak büyütün.
4. Yukarıdaki ön kültür hücrelerinin 2 ml'sini 1 L'lik bir şişede 50 μg / ml kanamisin içeren 200 ml LB suyuna aşılayın. Aşılanmış kültür şişesini, 600 nm'deki absorbans ultraviyole görünür (UV/VIS) spektrofotometre tarafından tespit edilen yaklaşık 0.4-0.5'e ulaşana kadar 170 rpm'de çalkalayarak 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
5. HP-NAP ekspresyonunu indüklemek için yukarıdaki kültüre 0.4 mM'lik bir nihai konsantrasyona 80 ul 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ekleyin. 600 nm'deki absorbans yaklaşık 1.6-1.7'ye ulaşana kadar kültürü 3 saat inkübe edin.
6. Süpernatanı çıkarmak için hücreleri 4 °C'de 6.000 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Hücre peletini saflaştırılana kadar -70 °C'de saklayın.

2. HP-NAP İçeren Çözünür Protein Fraksiyonunun Hazırlanması

NOT: Aşağıdaki adımların tümü 4 °C'de gerçekleştirilir.

1. Protokol adımı 1.6'da hazırlanan 50 ml hücre peletini, 0.13 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF), 0.03 mM N-alfa-tosil-L-lisinil-klorometilketon (TLCK) ve 0.03 mM N-tosil-L-fenilalaninil-klorometilketon (TPCK) içeren 20 ml 20 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM NaCl içinde daha önce tarif edildiği gibi 4 ° C'de yeniden süspanse edin.
2. Bakteri süspansiyonunu 4 °C'de 7 kez 15.000 ila 20.000 psi aralığında çalıştırılan yüksek basınçlı bir homojenizatörden geçirerek bakteri hücrelerini parçalayın.
3. Bir ultrasantrifüj kullanarak çözünür ve çözünmez protein fraksiyonlarını ayırmak için hücre lizatını 4 °C'de 30.000 × g'da 1 saat santrifüjleyin. Süpernatanı çözünür protein fraksiyonu olarak bir behere aktarın.
4. Üreticinin talimatlarına göre, standart olarak sığır serum albümini (BSA) içeren ticari bir kit kullanarak çözünür protein fraksiyonunun protein konsantrasyonunu Bradford yöntemiyle ölçün.
5. pH değerini pH 9.0'dan pH 8.0'a ayarlamak için Protokol adım 2.3'ten elde edilen çözünür protein fraksiyonunun 20 ml'sine 177.6 ul 1 N HCl ekleyin.
6. Nihai protein konsantrasyonunu 0.5 mg/ml yapmak için yukarıdaki protein çözeltisine 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl ekleyin.

3. Rekombinant HP-NAP'ın E. coli'den DEAE İyon Değiştirici Reçineler ile Negatif Mod Toplu Kromatografi ile Saflaştırılması

1. 15 ml dietilaminoetil (DEAE) reçinesi hazırlayın.
   1. 0,6 g kuru DEAE reçinesi tozunu tartın ve oda sıcaklığında en az 1 gün boyunca 30 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl içinde süspanse edin.
   2. Reçineyi 10.000 x g'da 4 °C'de 1 dakika santrifüjleyin.
   3. Süpernatanı çıkarın ve atın.
   4. 15 ml 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl ekleyin.
   5. Protokol 3.1.2 ila 3.1.4 adımlarını dört kez daha tekrarlayın.
   6. 15 ml çökeltilmiş reçineyi (30 ml Tris tamponunda %50 bulamaç) sonraki kullanım için 4 °C'de saklayın.
      NOT: Aşağıdaki adımların tümü 4 °C'de gerçekleştirilir.
2. Protokol adım 2.6'da hazırlanan 45 ml çözünür proteini 15 ml reçineye ekleyin ve protein/reçine bulamacını manyetik bir karıştırıcı ile 4 °C'de 1 saat karıştırın.
3. Protein/reçine bulamacını, musluk takılı plastik veya cam bir kolona dökün. Reçinenin yerçekimi altında çökmesine izin verin.
4. Kolondaki sıvı seviyesi reçinenin hemen üzerine gelene kadar protein çözeltisinin yerçekimi akışıyla kolondan geçmesine izin vermek için musluğu açın. Akışı, saflaştırılmış HP-NAP'yi içeren bağlanmamış fraksiyon olarak toplayın.
5. Kolona 15 ml buz gibi soğuk 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl ekleyin.
6. Kolondaki sıvı seviyesi reçinenin hemen üzerine gelene kadar yıkama tamponunun yerçekimi akışıyla kolondan geçmesine izin vermek için vanayı açın. Akışı yıkama fraksiyonu olarak toplayın.
7. Ek yıkama fraksiyonlarını toplamak için Protokol 3.5 ila 3.6 adımlarını dört kez daha tekrarlayın.

Malzemeler