<ol><li>Kültür süpernatantından proteinleri amonyum sülfat çökeltme ile konsantre edin. NOT: Hedef protein hücre içi ise hücre gövdelerinden ekstrakte edin.<ol style='list-style-type:decimal;'><li>Bakteri kültürü (Streptococcus mutans) süspansiyonunu 4 ° C'de 10.000 x g'da 20 dakika santrifüjleyin. Kültür süpernatanını 3 L'lik bir cam behere geri kazanın.</li><li>Manyetik bir karıştırıcı kullanarak kuvvetlice karıştırarak 2 L süpernatanta (%80 doygunluk) 1.122 g amonyum sülfat ekleyin. Karıştırarak çökeltinin 4 °C'de 4 saat veya daha uzun süre oluşmasına izin verin. NOT: Çökelti oluşumu gece boyunca devam ettirilebilir.</li><li>Amonyum sülfatla çökeltilmiş çözeltiyi 4 °C'de 20 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın.</li><li>Çökeltiyi bir spatula ile toplayın ve 200 mL'lik bir cam behere aktarın. Peletleri 35 mL bağlayıcı tampon (50 mM NaH2PO4 , 300 mM NaCl, 5 mM imidazol, pH 8.0) içinde yeniden süspanse edin.</li><li>Süspansiyonu, rejenere bir selüloz diyaliz tüpü kullanarak, 4 ° C'de karıştırarak 2.500 mL bağlama tamponuna karşı diyaliz edin. Diyaliz solüsyonunu 2 saat sonra değiştirin ve gece boyunca diyalize devam edin.</li><li>Diyaliz solüsyonunu tekrar değiştirin. 2 saat daha diyalize devam edin.</li></ol></li><li>Diyalize edilmiş süspansiyonu 4 °C'de 10 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin. Emme filtrasyon ekipmanı kullanarak süpernatanı bir membran filtreden süzün. Süzüntüyü 75cm2'lik bir şişeye aktarın.</li><li>Polihistidin etiketli Glukoziltransferaz-SI'yı (GTF-SI) süzülmüş süspansiyondan hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisi (IMAC) ile fraksiyonlara ayırın.<ol style='list-style-type:decimal;'><li>2 mL Ni yüklü IMAC reçine bulamacının (yaklaşık 1 mL reçine), çıkışı bir silikon tüpe takılan bir kromatografik kolona aktarın. Depolama çözeltisini yerçekimi akışıyla çıkarın. DİKKAT: Reçinenin IMAC boyunca kurumasına izin vermeyin.</li><li>Reçineyi yıkamak için kolona 3 mL damıtılmış su ekleyin. Reçineyi dengelemek için 5 mL bağlama tamponu ekleyin.</li><li>Akışı bir Hoffmann kıstırma musluğu ile kapatın. Bulamacı yapmak için 2. adımdan 5 mL filtrelenmiş süspansiyon ekleyin.</li><li>Tüm bulamacı kalan filtrelenmiş süspansiyona ekleyin. Karışımı 4 °C'de 30 dakika boyunca hafifçe döndürün.</li><li>Karışımı kolona geri yükleyin. Süspansiyonu yerçekimi akışıyla çıkarın. IMAC reçinesini 20 mL bağlayıcı tamponla yıkayın. NOT: Sonraki IMAC boyunca bir Hoffmann kıstırma musluğu ile akış hızını yaklaşık 2 mL/dk'ya ayarlayın.</li><li>Rekombinant GTF-SI'yi 20 mL elüsyon tamponu (50 mM NaH2PO4 , 300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8.0) ile seyreltin. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Elüat 4 °C'de saklanmalıdır. IMAC reçinesi tekrar kullanılabilir.</li></ol></li></ol>

<figure class='table'><table class='ck-table-resized'><colgroup><col style='width:25%;'><col style='width:25%;'><col style='width:25%;'><col style='width:25%;'></colgroup><tbody><tr><td>Santrifüj ultrafiltrasyon ünitesi</td><td>Sartorius</td><td>VS2032</td><td>Tampon replasmanı ve protein konsantrasyonu</td></tr><tr><td>Merkezkaç</td><td>Kubota Hakkında</td><td>7780II</td><td> </td></tr><tr><td>Kromatografik kolon</td><td>Biyo-Rad</td><td>7321010</td><td>IMAC için</td></tr><tr><td>Diyaliz membran kelepçesi</td><td>Fisher markası</td><td>21-153-100</td><td> </td></tr><tr><td>Diyaliz tüpü</td><td>Bir Olarak</td><td>2-316-06</td><td> </td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Uyan</td><td>095-00015</td><td>Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponu hazırlama</td></tr><tr><td>Kuvöz</td><td>Nippon Tıbbi & Kimyasal Aletler</td><td>LH-100-RDS</td><td>Sıcaklık ayarı: 37 °C</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Kubota Hakkında</td><td>3740</td><td> </td></tr><tr><td>Sodim klorür</td><td>Uyan</td><td>191-01665</td><td>Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponunun hazırlanması</td></tr><tr><td>Sodyum dihidrojen fosfat dihidrat</td><td>Uyan</td><td>192-02815</td><td>Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponunun hazırlanması</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Uyan</td><td>198-13765</td><td>Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponunun hazırlanması</td></tr><tr><td>Amonyum sülfat</td><td>Uyan</td><td>015-06737</td><td>Amonyum sülfat çökeltme</td></tr><tr><td>Ni yüklü reçine</td><td>Biyo-Rad</td><td>1560133</td><td>IMAC için</td></tr><tr><td>Membran filtre</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td>0,2 μm çap</td></tr></tbody></table></figure>

polihistidin etiketli bir proteinin streptococcus mutans'tan saflaştırılması İçin bir prosedür

A Procedure for the Purification of a Polyhistidine-Tagged Protein from Streptococcus mutans

Kaynak: <a href='https://app.jove.com/v/59804/purification-of-a-high-molecular-mass-protein-in-streptococcus-mutans'>Murata, T., vd. Streptococcus mutans'ta Yüksek Moleküler Kütleli Bir Proteinin Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2019)</a>Bu video, Streptococcus mutans'tan salgılanan polihistidin etiketli bir proteinin saflaştırılması için adım adım bir prosedürü göstermektedir.

Polihistidin Etiketli Bir Proteinin Streptococcus mutans'tan Saflaştırılması İçin Bir Prosedür

Source: Murata, T., et al. Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a ...

Ortama salgılanan polihistidin etiketli bir proteini eksprese eden bir Streptococcus mutans kültürünü ele alalım.Kültürü santrifüjleyin ve protein açısından zengin süpernatanı toplayın.Amonyum sülfat ekleyin ve proteinlerin çözünürlüklerini azaltarak çökeltmek için karıştırarak inkübe edin.Çözeltiyi bir tüpe aktarın, santrifüjleyin ve süpernatanı atın.Proteini stabilize etmek için peleti tuzlar ve düşük imidazol içeren bağlayıcı tamponda yeniden süspanse edin.Fazla tuzları gidermek için çözeltiyi taze bağlama tamponuna karşı diyaliz edin.Çözünmeyen kalıntıları pelet haline getirmek için diyalize edilmiş çözeltiyi santrifüjleyin, ardından süpernatanı filtreleyin.Süzüntüyü nikel yüklü afinite reçinesi ile karıştırın ve polihistidin etiketli proteinin nikel iyonlarına seçici bağlanmasına izin vermek için inkübe edin.Karışımı kromatografi kolonuna yükleyin ve bağlanmamış proteinleri çıkarmak için bağlayıcı tamponla yıkayın.Daha sonra, histidini nikel iyonlarından uzaklaştırmak ve polihistidin etiketli proteini serbest bırakmak için yüksek imidazol içeren bir elüsyon tamponu ekleyin.Saflaştırılmış proteinleri içeren bu elüatı toplayın.Bakteri kültürü süspansiyonunu dört santigrat derecede 10.000 kez g'da 20 dakika santrifüjleyin.Kültür süpernatanını üç litrelik bir cam behere aktarın. Kültür süpernatantından proteinleri konsantre etmek için, iki litrelik süpernatanı manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin ve kuvvetlice karıştırmaya başlayın. 1.122 gram amonyum sülfat ekleyin ve 4 saatlik bir süre boyunca veya gece boyunca dört santigrat derecede kuvvetlice karıştırarak çökeltinin oluşmasına izin verin.Daha sonra, amonyum sülfat çökeltilmiş çözeltiyi 15.000 kez g'da 20 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın. Bir spatula ile çökeltiyi toplayın ve 200 mililitrelik bir cam behere aktarın.Peletleri 35 mililitre bağlayıcı tamponda yeniden süspanse edin. Ardından, süspansiyonun yaklaşık 25 mililitresini rejenere bir selüloz diyaliz tüpüne aktarın. Süspansiyonu diyalize etmek için diyaliz tüpünü dört santigrat derecede bir karıştırıcı üzerindeki 2,5 litre karıştırma bağlama tamponuna yerleştirin.Diyaliz solüsyonunu iki saat sonra değiştirin ve gece boyunca diyalize devam edin. Daha sonra, diyalize edilmiş süspansiyonu borudan santrifüj tüplerine aktarın ve tüpleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 20.000 kez g'da santrifüje yerleştirin. Emme filtrasyon ekipmanıyla, filtrelemek için süpernatanı 0,2 mikrometrelik bir membran filtrenin üzerine dökün.Süzüntüyü 75 mililitrelik bir şişeye aktarın.Polihistidin etiketli gtfSI'yi filtrelenmiş süspansiyondan fraksiyonlara ayırmak için önce hareketsizleştirilmiş bir metal afinite kromatografisi hazırlayın. Reçineyi el yazmasına göre dengeledikten sonra, Hoffman kıstırma musluğunu kapatın.Bir bulamaç yapmak için kolona beş mililitre filtrelenmiş süspansiyon ekleyin. Ardından, tüm bulamacı kalan filtrelenmiş süspansiyona aktarın ve karışımı dört santigrat derecede 30 dakika boyunca hafifçe döndürün. Karışımı kolona geri yükleyin.Süspansiyonu yerçekimi akışıyla çıkarmak için Hoffman kıstırma musluğunu açın. IMAC reçinesini 20 mililitre bağlayıcı tamponla yıkayın ve ardından rekombinant gtfSI'yi elde etmek için 20 mililitre elüsyon tamponunu ayrıştırın.

a-procedure-for-purification-polyhistidine-tagged-protein-from

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Microbiology

Mikrobiyoloji

Bacterial Growth and Techniques

Bakteriyel Büyüme ve Teknikler

Isolation and Fractionation Techniques

İzolasyon ve Fraksiyonalama Teknikleri

442 Görüntüleme. Ortama salgılanan polihistidin etiketli bir proteini eksprese eden bir Streptococcus mutans kültürünü ele alalım.Kültürü santrifüjleyin ve protein açısından zengin süpernatanı toplayın.Amonyum sülfat ekleyin ve proteinlerin çözünürlüklerini azaltarak çökeltmek için karıştırarak inkübe edin.Çözeltiyi bir tüpe aktarın, santrifüjleyin ve süpernatanı atın.Proteini stabilize etmek için peleti tuzlar ve düşük imidazol içer...

Polihistidin Etiketli Bir Proteinin Streptococcus mutans'tan Saflaştırılması İçin Bir Prosedür

Bu makalede

Özet

Protokol

Malzemeler

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Santrifüj ultrafiltrasyon ünitesi	Sartorius	VS2032	Tampon replasmanı ve protein konsantrasyonu
Merkezkaç	Kubota Hakkında	7780II
Kromatografik kolon	Biyo-Rad	7321010	IMAC için
Diyaliz membran kelepçesi	Fisher markası	21-153-100
Diyaliz tüpü	Bir Olarak	2-316-06
İmidazol	Uyan	095-00015	Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponu hazırlama
Kuvöz	Nippon Tıbbi & Kimyasal Aletler	LH-100-RDS	Sıcaklık ayarı: 37 °C
Mikrosantrifüj	Kubota Hakkında	3740
Sodim klorür	Uyan	191-01665	Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponunun hazırlanması
Sodyum dihidrojen fosfat dihidrat	Uyan	192-02815	Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponunun hazırlanması
Sodyum hidroksit	Uyan	198-13765	Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponunun hazırlanması
Amonyum sülfat	Uyan	015-06737	Amonyum sülfat çökeltme
Ni yüklü reçine	Biyo-Rad	1560133	IMAC için
Membran filtre	Merck Millipore	JGWP04700	0,2 μm çap