Polihistidin Etiketli Bir Proteinin Streptococcus mutans'tan Saflaştırılması İçin Bir Prosedür

Özet

Kaynak: Murata, T., vd. Streptococcus mutans'ta Yüksek Moleküler Kütleli Bir Proteinin Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, Streptococcus mutans'tan salgılanan polihistidin etiketli bir proteinin saflaştırılması için adım adım bir prosedürü göstermektedir.

Protokol

1. Kültür süpernatantından proteinleri amonyum sülfat çökeltme ile konsantre edin.
   NOT: Hedef protein hücre içi ise hücre gövdelerinden ekstrakte edin.
   1. Bakteri kültürü (Streptococcus mutans) süspansiyonunu 4 ° C'de 10.000 x g'da 20 dakika santrifüjleyin. Kültür süpernatanını 3 L'lik bir cam behere geri kazanın.
   2. Manyetik bir karıştırıcı kullanarak kuvvetlice karıştırarak 2 L süpernatanta (%80 doygunluk) 1.122 g amonyum sülfat ekleyin. Karıştırarak çökeltinin 4 °C'de 4 saat veya daha uzun süre oluşmasına izin verin.
      NOT: Çökelti oluşumu gece boyunca devam ettirilebilir.
   3. Amonyum sülfatla çökeltilmiş çözeltiyi 4 °C'de 20 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın.
   4. Çökeltiyi bir spatula ile toplayın ve 200 mL'lik bir cam behere aktarın. Peletleri 35 mL bağlayıcı tampon (50 mM NaH₂PO₄ , 300 mM NaCl, 5 mM imidazol, pH 8.0) içinde yeniden süspanse edin.
   5. Süspansiyonu, rejenere bir selüloz diyaliz tüpü kullanarak, 4 ° C'de karıştırarak 2.500 mL bağlama tamponuna karşı diyaliz edin. Diyaliz solüsyonunu 2 saat sonra değiştirin ve gece boyunca diyalize devam edin.
   6. Diyaliz solüsyonunu tekrar değiştirin. 2 saat daha diyalize devam edin.
2. Diyalize edilmiş süspansiyonu 4 °C'de 10 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin. Emme filtrasyon ekipmanı kullanarak süpernatanı bir membran filtreden süzün. Süzüntüyü 75^cm2'lik bir şişeye aktarın.
3. Polihistidin etiketli Glukoziltransferaz-SI'yı (GTF-SI) süzülmüş süspansiyondan hareketsizleştirilmiş metal afinite kromatografisi (IMAC) ile fraksiyonlara ayırın.
   1. 2 mL Ni yüklü IMAC reçine bulamacının (yaklaşık 1 mL reçine), çıkışı bir silikon tüpe takılan bir kromatografik kolona aktarın. Depolama çözeltisini yerçekimi akışıyla çıkarın.
      DİKKAT: Reçinenin IMAC boyunca kurumasına izin vermeyin.
   2. Reçineyi yıkamak için kolona 3 mL damıtılmış su ekleyin. Reçineyi dengelemek için 5 mL bağlama tamponu ekleyin.
   3. Akışı bir Hoffmann kıstırma musluğu ile kapatın. Bulamacı yapmak için 2. adımdan 5 mL filtrelenmiş süspansiyon ekleyin.
   4. Tüm bulamacı kalan filtrelenmiş süspansiyona ekleyin. Karışımı 4 °C'de 30 dakika boyunca hafifçe döndürün.
   5. Karışımı kolona geri yükleyin. Süspansiyonu yerçekimi akışıyla çıkarın. IMAC reçinesini 20 mL bağlayıcı tamponla yıkayın.
      NOT: Sonraki IMAC boyunca bir Hoffmann kıstırma musluğu ile akış hızını yaklaşık 2 mL/dk'ya ayarlayın.
   6. Rekombinant GTF-SI'yi 20 mL elüsyon tamponu (50 mM NaH₂PO₄ , 300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8.0) ile seyreltin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Elüat 4 °C'de saklanmalıdır. IMAC reçinesi tekrar kullanılabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Santrifüj ultrafiltrasyon ünitesi	Sartorius	VS2032	Tampon replasmanı ve protein konsantrasyonu
Merkezkaç	Kubota Hakkında	7780II
Kromatografik kolon	Biyo-Rad	7321010	IMAC için
Diyaliz membran kelepçesi	Fisher markası	21-153-100
Diyaliz tüpü	Bir Olarak	2-316-06
İmidazol	Uyan	095-00015	Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponu hazırlama
Kuvöz	Nippon Tıbbi & Kimyasal Aletler	LH-100-RDS	Sıcaklık ayarı: 37 °C
Mikrosantrifüj	Kubota Hakkında	3740
Sodim klorür	Uyan	191-01665	Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponunun hazırlanması
Sodyum dihidrojen fosfat dihidrat	Uyan	192-02815	Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponunun hazırlanması
Sodyum hidroksit	Uyan	198-13765	Bağlanma tamponu ve elüsyon tamponunun hazırlanması
Amonyum sülfat	Uyan	015-06737	Amonyum sülfat çökeltme
Ni yüklü reçine	Biyo-Rad	1560133	IMAC için
Membran filtre	Merck Millipore	JGWP04700	0,2 μm çap