Tüberküloz Lezyonlarından Kazeuma İlaç Bağlanmasının Hızlı Denge Diyaliz Yöntemi ile Ölçülmesi

Özet

Kaynak: Sarathy, J. P. ve diğerleri. Tüberküloz Lezyonlarında İlaç Penetrasyonunu Tahmin Eden Bir İn Vitro Caseum Bağlanma Testi. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, hızlı denge diyalizi kullanılarak tüberküloz lezyonlarından kazeuma ilaç bağlanmasını ölçmek için bir in vitro testi göstermektedir. Kazeum süspansiyonlarının hazırlanması, diyaliz yapılması ve kazeuma ilaç penetrasyonunu tahmin etmek için bağlanmamış ilaç fraksiyonunun hesaplanması için adımları özetlemektedir.

Protokol

1. Hızlı Dengeleme Diyalizi (RED) Testi

1. 5 μM (%≤1 DMSO) ve girdabın nihai konsantrasyonunu elde etmek için test bileşiğinin 500 μM çözeltisinin 6,5 μL'sini 643,5 μL homojenata yerleştirin.
2. KIRMIZI ekleri taban plakasına yerleştirin. Her bir RED ekinin donör odasına (kırmızı halka) 200 μL ilaç çivili matris ve her alıcı odaya 350 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. Her test bileşiği için 3 ek hazırlayın (numuneleri üçe katlayın). Plakayı yapışkan bir plaka contası ile kapatın ve termomikserde 37 °C'de 200 rpm'de (1 x g) 4 saat inkübe edin.
3. İnkübasyondan sonra, donör ve alıcı odaların içeriğini 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın. Donör odalarından 20 μL homojenat alikotlarını pipetleyin ve 1.5 mL'lik bir tüpte (1:1) 20 μL temiz PBS'ye ekleyin. Benzer şekilde, alıcı odalardan 20 μL PBS numunesi alikotlarını pipetleyin ve 20 μL temiz homojenata ekleyin (matris eşleştirme).
   NOT: Matris eşleştirme, kantitatif analiz için 2 ayrı kalibrasyon eğrisinin (homojenat ve PBS'de) yapılması ihtiyacını ortadan kaldırır. Donör odasının içeriği zamanla çökelebilir. Alikotları çıkarmadan önce içeriği pipetleyerek yavaşça karıştırın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Pierce RED Cihazı Yeniden Kullanılabilir Taban Plakası	Fisher Bilimsel	PI-89811
Pierce RED Cihaz Ekleri, 50/kutu	Fisher Bilimsel	PI-89809
Pierce RED kesici uç çıkarma aleti	Fisher Bilimsel	89812
Yapışkan plaka contası	Fisher Bilimsel	08-408-240
PBS, pH 7,4, 10x 500 mL (Gibco)	Yaşam Teknolojileri	10010-049
DMSO'nun	Sigma	472301