Bakterilerde Antibiyotik Kalıcılığını İncelemek için Mikroakışkan Hızlandırılmış Mikroskopi

Abstract

Kaynak: Oms, T., ve diğerleri. Escherichia coli'de Antibiyotik Kalıcılığının Popülasyon ve Tek Hücre Analizi. J. Vis. Uzm. (2023)

Bu video, mikroakışkan bir sistem içinde floresan etiketli bir DNA bağlayıcı proteini eksprese eden bireysel bakteri hücrelerini izlemek için bir protokol sunar. Antibiyotiklerin çoğu hücreyi nasıl inhibe ettiğini, kalıcı hücrelerin bir alt popülasyonunun tedaviden sağ çıktığını ve antibiyotiğin çıkarılmasının ardından yeniden büyüdüğünü gösterir.

Protocol

Mikroakışkan hızlandırılmış mikroskopi görüntüleme

NOT: Aşağıdaki bölüm, mikroakışkan plakanın hazırlanmasının yanı sıra hızlandırılmış görüntü elde etme ve görüntü analiz prosedürünü açıklamaktadır. Bu deneyin amacı, tek hücre düzeyinde antibiyotik tedavisi üzerine kalıcılık fenotipini gözlemlemek ve analiz etmektir. Bu deney sırasında toplanan veriler, ele alınan soruya ve/veya deney sırasında kullanılan floresan raportörlere bağlı olarak çok çeşitli sonuçlar üretmek için kullanılabilir. Burada açıklanan deneyde, kalıcı ve kalıcı olmayan hücrelerde nükleoid organizasyonu yansıtan hücre uzunluğunun ve HU-mCherry floresansının kantitatif analizi gerçekleştirildi.

1. Mikroakışkan hızlandırılmış mikroskopi için bakteri hücre kültürü
   1. 5 mL ortamı (3-[N-morfolino] propansülfonik asit (MOPS) gliserol% 0.4, gerekirse seçici bir antibiyotikle desteklenmiş) bir cam tüp (≥25 mL) içinde izole edilmiş bir koloni ile aşılayın ve tüpü gece boyunca 37 ° C'ye ve 180 rpm'ye ayarlanmış çalkalayıcı bir inkübatöre yerleştirin (15 saat ile 19 saat arasında).
   2. Ertesi gün, OD₆₀₀ nm'yi ölçün ve kültürü taze sıcaklık ayarlı ortamda (37 °C, MOPS gliserol% 0.4) bir cam tüp içinde nihai OD₆₀₀ nm ~0.001'e kadar seyreltin. Ertesi gün erken üstel faz kültürü elde etmek için kültürün 37 ° C ve 180 rpm'de çalkalanan bir inkübatörde gece boyunca (15 saat ile 19 saat arasında) büyümesine izin verin.
2. Mikroakışkan plakanın hazırlanması ve hızlandırılmış mikroskopi görüntüleme
   NOT: Mikroakışkan deneyleri, ticari olarak temin edilebilen mikroakışkan cihazlarda (burada açıklandığı gibi) veya şirket içinde üretilen mikroakışkan sistemlerde gerçekleştirilebilir.
   1. Koruma solüsyonunu (varsa) mikroakışkan plakanın her kuyucuğundan çıkarın ve taze bir kültür ortamı ile değiştirin.
      NOT: Mikroakışkan plaka bir atık çıkış kuyusu içeriyorsa, çıkış kuyusunun koruma solüsyonu çıkarılmalı ancak ortam ile değiştirilmemelidir.
   2. Mühürleme düğmesine tıklayarak veya mikroakışkan yazılım aracılığıyla mikroakışkan plakayı manifold sistemiyle kapatın (önce Araç'ı, ardından Mühür Plakasını seçin).
      NOT: Plakayı kapatmak için, plakayı manifolda doğru manuel olarak sıkarak plakaya ve manifolda eşit basınç uygulanmalıdır. Doğru yapılırsa, ONIX2 arayüzünde "mühürlü" notu görünmelidir. Manifoldun kırılma riskini önlemek için cam kızağa herhangi bir basınç uygulamamak önemlidir.
   3. Mühürlendikten sonra, ilk hazırlama dizisini gerçekleştirin (mikroakışkan yazılım arayüzünde Sıvı Hazırlama Sırasını Çalıştır'a tıklayın).
      NOT: Sıvı Hazırlama Sırasını Çalıştırın , 1-5 kuyucukları için 6,9 kPa'da 5 dakikalık perfüzyona, ardından kuyu 8 için 6,9 kPa'da 5 dakikalık perfüzyona ve 6,9 kPa'da 5 dakika boyunca kuyu 6 için son bir perfüzyon turuna karşılık gelir. Run Liquid Hazırlama Sırası , farklı kuyucukları birbirine bağlayan kanallarda hala mevcut olabilecek koruma solüsyonunun çıkarılmasına izin verir.
   4. Mikroskopi görüntülemenin başlamasından önce plakayı mikroskobun termostatik olarak kontrol edilen bir kabininde istenen sıcaklıkta (burada, 37 °C) en az 2 saat inkübe edin.
   5. Deneye başlamadan önce ikinci bir Sıvı Hazırlama Sırası Çalıştır başlatın.
   6. Mikroakışkan yazılım arayüzünde Mühürle seçeneğine tıklayarak mikroakışkan plakayı kapatın. Kuyu 1 ve kuyu 2'deki ortamı 200 μL taze ortamla, kuyu 3'teki ortamı antibiyotik içeren 200 μL taze ortamla (burada, 5 μg·^mL-1'de ofloksasin (OFX)), kuyu 4 ve kuyu 5'te 200 μL taze ortamla, kuyu 6'da 200 μL taze ortamla, ve kuyu 8'de, taze ortamda 200 μL kültür numunesi (adım 1.2'den itibaren)₆₀₀ nm'lik bir OD 0.01'e seyreltilir.
   7. Mikroakışkan plakayı adım 2.2'de açıklandığı gibi kapatın ve mikroskop kabininin içindeki mikroskop objektifine yerleştirin.
      NOT: Mikroakışkan plakayı yerleştirmeden önce mikroskop objektifine bir damla daldırma yağı damlattığınızdan emin olun.
   8. Mikroakışkan yazılımda, hücrenin mikroakışkan plakaya yüklenmesine izin vermek için Hücre Yükleme'ye tıklayın.
      NOT: Hücre Yükleme adımı, kuyu 8 için 13,8 kPa'da 15 sn perfüzyon, ardından kuyu 6 ve kuyu 8 için 27,6 kPa'da 15 sn perfüzyon ve kuyu 6 için 6,9 kPa'da 30 saniye boyunca son bir perfüzyon turundan oluşur. Mikroakışkan plakadaki hücrelerin yoğunluğu deney için kritik öneme sahiptir. Bu mikroakışkan protokolün ilk kısmı, antibiyotik tedavisinden önce taze bir ortamda 6 saat boyunca bakteri yetiştirmekten oluşur. 6 saatlik büyümeden sonra, hücre yoğunluğunun nadir kalıcı hücreleri tespit etmek için yeterli olması gerekir (bu çalışmada kullanılan koşullarda, kalıcı hücreler 10⁻⁴ frekansında üretilir). Hücre yoğunluğu çok yüksekse, tek tek hücreleri ayırt etmek zordur, bu da hassas tek hücre analizini engeller. Büyüme hızı doğrudan ortama bağlı olduğundan, deney başlatılmadan önce mikroskopi alanlarındaki hücrelerin yoğunluğu değerlendirilmelidir.
   9. İletilen ışık modunu kullanarak en uygun odağı ayarlayın ve uygun bir hücre sayısının gözlemlendiği (alan başına 300 hücreye kadar) birkaç ilgi alanı (ROI) seçin.
      NOT: Nadir kalıcı hücrelerin görüntülendiğinden emin olmak için en az 40 ROI seçin.
   10. Mikroakışkan yazılımda, Protokol Oluştur'a tıklayın. Taze ortam enjeksiyonunu 6 saat boyunca 6.9 kPa'da (kuyu 1-2), ardından antibiyotik içeren ortamın 6.9 kPa'da 6 saat boyunca enjeksiyonunu (kuyu 3) ve son olarak, taze ortam enjeksiyonunu 6.9 kPa'da 20 saat boyunca (kuyu 4-5) programlayın.
       NOT: OD₆₀₀ nm 0.01'e seyreltilmiş bir bakteri kültürü, bakterilerin mikroakışkan odada 6 saat boyunca büyümesine izin vererek hücrelerin üstel büyüme fazında olmasını sağlar. Yükleme adımı sırasında mikroakışkan cihaza verilen hücre sayısına bağlı olarak (bkz. adım 2.8), büyüme aşamasının süresi, ROI başına 300 hücreye kadar elde edilecek şekilde uyarlanabilir. Kalıcılık nadir görülen bir fenomen olduğundan, ROI başına hücre sayısını artırmak, kalıcı hücreleri gözlemleme olasılığını artırır. Bununla birlikte, hücre sayısı, tek hücre analizini sıkıcı hale getirdiğinden, ROI başına 300 hücreyi geçmemelidir.
   11. İletilen ışığı ve floresan raportör için uyarma ışık kaynağını kullanarak her 15 dakikada bir kare ile hızlandırılmış modda mikroskopi görüntüleme gerçekleştirin. Burada, mCherry sinyali için 560 nm'lik bir uyarma ışık kaynağı kullanıldı (00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] filtresi ile %10 güçte 580 nm LED ve mCherry için 100 ms pozlama). Hücre görüntüleme için Zeiss uyumlu Zen3.2 yazılımı kullanıldı.
3. Görüntü analizi
   NOT: Mikroskopi görüntülerinin açılması ve görselleştirilmesi, açık kaynaklı ImageJ/Fiji yazılımı (https://fiji.sc/) ile gerçekleştirilir. Kantitatif görüntü analizi, açık kaynaklı ImageJ/Fiji yazılımı ve ücretsiz MicrobeJ eklentisi (https://microbej.com) kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokolde MicrobeJ 5.13I(14) versiyonu kullanılmıştır.
   1. Bilgisayarda ImageJ/Fiji yazılımını açın ve hiper yığın hızlandırılmış mikroskopi görüntülerini Fiji yükleme çubuğuna sürükleyin. Hiper yığının farklı kanallarını birleştirmek için Görüntü > Renk > Bileşik Oluştur'u kullanın. Hızlandırılmış deneyin kanalları istenen renge karşılık gelmiyorsa (örneğin, faz kontrastı gri yerine kırmızı olarak gösteriliyorsa), kanallara uygun rengi uygulamak için Görüntü > Renk > Kanalları Düzenle'yi kullanın.
   2. MicrobeJ eklentisini açın ve manuel düzenleme arayüzünü kullanarak bakteri hücrelerini tespit edin. Otomatik olarak algılanan hücreleri silin ve ilgilenilen kalıcı hücreleri kare kare manuel olarak ana hatlarıyla belirtin.
      NOT: Tek tek hücreleri otomatik olarak algılamak için farklı ayarlar kullanılabilir. Analiz edilen kalıcı hücreler, otomatik algılama kullanılarak nadiren doğru şekilde tespit edilen uzun filamentler oluşturduğundan, burada manuel algılama kullanıldı.
   3. Algılamadan sonra, bir ResultJ tablosu oluşturmak için MicrobeJ manuel düzenleme arayüzündeki Sonuç simgesini kullanın. ResultJ dosyasını kaydedin ve tek hücreli analizde ilgilenilen farklı parametreler hakkında bilgi edinmek için kullanın. Bu protokolde, HU-mCherry yoğunluğunun ortalama floresansı, hücre uzunluğu ve tek tek hücrelerin hücre alanı dışa aktarıldı.

Materials