Bir Floresan Raportör Proteini Eksprese Eden Bakteriler Kullanılarak Siklik di-GMP Modülatörlerinin Taranması

Abstract

Kaynak: Rugjee, K. N., ve diğerleri. Pseudomonas aeruginosa'da c-di-GMP Sinyalini Modüle Eden Küçük Moleküllerin Taranması için Yüksek Verimli Bir Kurulumun Kurulması. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, c-di-GMP'ye duyarlı bir promotörün kontrolü altında yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden genetiği değiştirilmiş bakteriler kullanılarak siklik di-GMP modülatörlerinin taranmasını göstermektedir. Floresan, farklı test bileşikleri içeren çok kuyulu bir plakada ölçülür. C-di-GMP üretimini engelleyen bileşikler floresansın azalmasına neden olur. Veriler daha sonra bakterilerde c-di-GMP sinyalinin potansiyel modülatörlerini belirlemek için analiz edilir.

Protocol

1. Yeşil Floresan Protein (GFP) Üretimi Etiketli siklik di-GMP (c-di-GMP) Raportör Pseudomonas aeruginosa Suşu

1. 5 ml lizojeni suyu (LB) ortamını tek bir P. aeruginosa kolonisi ile aşılayın ve 200 rpm'de çalkalayarak 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.
2. 2 ml gece kültürünü 1 L'lik bir şişede 200 ml taze LB ortamına aktarın ve 200 rpm'de çalkalayarak 37 °C'de inkübe edin.
3. Şişeden 1 ml'lik bir numune alarak ve bir spektrofotometre kullanarak inceleyerek her 30 dakikada bir 600 nm'de (OD₆₀₀) optik yoğunluğu izleyin.
4. OD₆₀₀ 0,3 - 0,5 arasına ulaştığında, 40 ml kültürü 50 ml'lik konik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
5. Hücreleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 8.000 rpm'de santrifüjleyerek pelet haline getirin, süpernatanı atın ve hücreleri 40 ml buz gibi, steril, 300 mM sükroz çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.
6. Adım 1.5'te açıklandığı gibi santrifüj ederek hücreleri ikinci kez pelet haline getirin ve 20 ml buz gibi, steril, 300 mM sükroz çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.
7. Adım 1.5'te açıklandığı gibi santrifüjleyerek hücreleri son bir kez pelet haline getirin ve 400 ul buz gibi soğuk, steril, 300 mM sükroz çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.
   Not: Bu noktadaki hücre yoğunluğu, mililitrede (CFU/ml) yaklaşık 1 x 10¹¹ koloni oluşturan birim olmalıdır.
8. Hücreleri buz üzerinde 30 dakika soğutun, ardından elektroporasyona hazır hale getirin.
9. Buz üzerinde önceden soğutulmuş 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpünde yukarıda hazırlanan 40 μl P. aeruginosa elektro-yetkin hücrelere 1 μl 0.2 μg/μl pCdrA::gfp^C plazmit çözeltisi ekleyin. Süspansiyonu karıştırın ve önceden soğutulmuş, 2 mm'lik bir elektrot boşluğuna, elektroporasyon küvetine aktarın.
10. Küvetin dışındaki nemi kağıt mendille alın ve küveti elektroporatörün numune odasına yerleştirin. 2,5 kV gerilim, 25 μF kapasitans ve 200 Ω dirençli darbe.
11. Küveti çıkarın ve 1 ml LB ortamı ekleyin. Daha sonra hücreleri steril 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 200 rpm'de çalkalayarak 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
12. Kültürün 10 μl, 50 μl ve 100 μl alikotlarını ampisilin (100 μg/ml konsantrasyonda) ile desteklenmiş steril LB-agar plakalarına yayın ve plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
13. Plakayı standart bir GFP kanalı ile bir floresan mikroskobu altında inceleyerek GFP ekspresyonunu (485 nm'de uyarma, 520 nm'de emisyon) doğrulayın ve 5 mL LB'yi aşılamak için tek bir koloni seçin. Adım 1.1'de açıklandığı gibi gece boyunca inkübe edin. 0.5 ml gece kültürünü 0.5 ml %50 gliserol ile 2 ml'lik vidalı kapaklı bir tüpte karıştırın ve -80 °C'de saklayın.

2. Aşılama için Başlangıç Kültürünün Hazırlanması

1. Taramadan iki gün önce, P . aeruginosa suşu (pCdrA::gfp^C plazmitini içeren) -80 °C stoktan bir LB-agar plakasına (100 μg/ml konsantrasyonda ampisilin ile desteklenmiş) steril bir aşılama döngüsü kullanarak bakterileri plaka üzerine nazikçe yayarak plakalayın. Plakayı gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
2. Taramadan önceki akşam, plakadan tek bir P. aeruginosa kolonisini bir tüp içinde 10 ml LB ortamına (100 μg/ml konsantrasyonda ampisilin ile desteklenmiş) aşılayın ve ön kültürü gece boyunca 37 °C'de 200 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
3. Gösterim gününde, önce taze LB ortamı ile 1.0'lık bir OD_600'e kadar seyrelterek ve ardından %5 LB ile 0.04'lük bir OD_600'e (1:25 oranı) seyrelterek gece ön kültüründen bir alt kültür hazırlayın.
   Not: Aşılanan ortamın toplam hacmi, test edilecek plaka sayısına bağlıdır. %5 LB, %100 LB'nin fosfat tamponlu salin (PBS) ile gerekli konsantrasyona seyreltilmesiyle yapılır. Önemli olarak, ortam (%5 LB), pCdrA::gfp^C'nin yapısal aktivasyonuna izin verir.
4. Kaba steril bir manyetik karıştırıcı çubuğu ekleyin ve kültürü oda sıcaklığında 30 dakika boyunca manyetik bir karıştırıcı üzerinde minimum hızda karıştırın, böylece bakterilerin 384 oyuklu plakalara dağıtılmadan önce ortama alışmasını sağlayın.

3. Küçük Moleküller İçeren 384 Kuyucuklu Plakaların Aşılanması ve İnkübasyonu

Not: Sterilite ve iyi aseptik teknikler aşağıdaki adımlar için çok önemlidir.

1. Pozitif kontrolü (%100 inhibisyon) hazırlamak için, Adım 2.3'te hazırlanan alt kültürün 10 ml'sine (12 tabağa kadar yeterli) 20 ul tobramisin sülfat (25 mg/ml) ekleyin ve hafifçe karıştırın. Pozitif kontrol kültürünün 40 μl'sini A23-P23 kuyucuklarına pipetleyin (Şekil 1).
2. Negatif kontrolü (% 0 inhibisyon) hazırlamak için, Adım 2.3'te hazırlanan alt kültürün 10 ml'sine (12 plakaya kadar yeterli) 30 ul dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve hafifçe karıştırın. Negatif kontrol kültürünün 40 μl'sini A24-P24 kuyucuklarına pipetleyin (Şekil 1).
3. Küçük moleküllerle damgalanmış plakaların her biri için, seyreltilmiş gece kültürlerinin (Adım 2.3'te açıklanmıştır) 40 μl'lik bir hacmini A1-P22 kuyucuklarına aşılayın (Şekil 1).
   Not: Bu, bir sıvı işleme robotu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bakteri kültürlerinin heterojen özelliklerinden dolayı, dağıtım sırasında bakterilerin ortamda tutarlı bir şekilde dağılmasını sağlamak için sürekli ve orta derecede bir çalkalama sağlamak önemlidir. Bunu yapmak için, dağıtım sırasında adım 2.4'ten itibaren iklimlendirilmiş kültürü manyetik olarak karıştırmaya devam edin.
4. Plakaları hava geçirgen bir kapak contası ile kapatın ve 37 °C'de 6 saat inkübe edin.
   Not: Hava geçirgen conta, 384 kuyunun tamamında değişmeyen koşulları korumak ve plaka boyunca oksijen gradyanlarının potansiyel gelişimini önlemek için kritik öneme sahiptir.

4. Büyüme Ölçümü (OD600) ve Hücre İçi c-di-GMP Düzeyi (GFP)

1. Spektrofotometrik ölçümden yaklaşık 30 dakika önce, yoğuşmayı önlemek için plaka okuyucuyu 37 °C'ye ısıtın.
2. Okumadan önce hava geçirgen kapak contasını yavaşça çıkarın. Optik yoğunluğu, kuyu başına 10 flaş ayarı ve 0,2 saniyelik bir yerleşme süresi ile 600 nm dalga boyunda ölçün.
3. Floresansı ölçmeden önce, A24 kuyusuna (negatif kontrol) dayalı olarak otomatik bir kazanç ve odak ayarı yapın ve kazanç hedef değerini %75'e ayarlayın (Şekil 1).
   1. Plaka okuyucu kontrol yazılımından ölçümü başlat'a tıklayın ve ''Odak ve Kazanç Ayarı/Plaka Kimlikleri'' sekmesine tıklayın.
   2. Pencerenin sağındaki "Odak Ayarı" ve "Kanal A"yı seçin.
   3. ''Kazanç Ayarı'' ve ''Seçilmiş kuyu''yu seçin ve ''Hedef değer'' olarak ''75'' yazın. Son olarak, ''Ayarlamayı Başlat''a tıklamadan önce plaka düzeninde A24 kuyusunu seçin. Ayarlama yapıldıktan sonra ''Ölçümü başlat'' seçeneğine tıklayın.
   4. GFP raportöründen gelen floresansı, kuyu başına 10 flaş ayarı ve 0,2 saniyelik bir yerleşme süresi ile 485/520 nm'lik bir uyarma/emisyon maksimumunda ölçün.
4. İncelenen tüm plakalardan veri toplayın.
   Not: Veri okumaları, plaka okuyucu kontrol yazılımı tarafından otomatik olarak varsayılan olarak kaydedilir.
   1. İstatistiksel analiz paketini açmak için kontrol yazılımındaki "Mars" simgesine tıklayarak okumaları görüntüleyin.
   2. Analiz için verilere erişmek için ilgilenilen plaka numarasına "çift tıklayarak" verileri alın.

Results

Şekil 1. Küçük Molekül Tarama Testi için Kullanılan 384 Oyuklu Plaka Haritası. Kütüphanedeki bileşikler (açık mavi) A1-P22 kuyularına alikot edilir. 50 μg/ml tobramisin sülfatın nihai konsantrasyonundan oluşan "pozitif kontrol" (kırmızı), A23...

Materials