Monoklonal Bakteri Kültürü Hazırlama Tekniği

Özet

Kaynak: Lin, P., ve diğerleri. Bakteriyel mineral atılımı yoluyla sodyum tungstat ve sodyum molibdat mikrokapsüllerinin sentezlenmesi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, bir agar plakası üzerinde seri seyreltme ve koloni izolasyonu yoluyla mineral üretimi için bir monoklonal bakteri kültürünün hazırlanmasını göstermektedir. Plakayı cam boncuklarla sallayarak, tek tek hücreler genetik olarak tekdüze koloniler oluşturmak üzere uzamsal olarak ayrılır ve bunlar daha sonra büyüme için sıvı ortama aktarılır. En yoğun monoklonal popülasyonu ve en büyük mineral çıkışı potansiyelini gösteren en yüksek bulanıklığa sahip kültür seçilir.

Protokol

1. Cam Boncukların Hazırlanması

1. 100 mL'lik bir laboratuvar şişesine 3 mm çapında 100 cam boncuk yerleştirin ve ardından sıkıca kapatın.
2. İçeriği 120 °C'de 10 dakika otoklavlayın.
3. Şişeyi oda sıcaklığına soğumaya bırakın, ardından biyogüvenlik kabinine yerleştirin.

2. Lizojeni Suyunun (LB) Hazırlanması

1. 8 g LB-Lennox et suyu tozunu 500 mL'lik bir laboratuvar şişesinde 400 mL su ile eritin.
2. İçeriği bir politetrafloroetilen (PTFE) manyetik karıştırma çubuğu ile 20 dakika karıştırın ve ardından sıkıca kapatın.
3. İçeriği 120 °C'de 10 dakika otoklavlayın.
4. Çözeltiyi oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
5. Bir pipet kullanarak et suyunu biyogüvenlik kabininde sekiz adet 15 mL'lik santrifüj tüpüne (her biri 12,5 mL) ayırın.
6. Kalan suyu biyogüvenlik kabininde (her biri 100 mL) üç adet 100 mL'lik laboratuvar şişesine ayırın. Üç şişeyi sıkıca kapatın. Bunları biyogüvenlik kabininde saklayın.

3. Shewanella yosunu kültürü

1. Derin dondurulmuş dondurularak saklanmış suşu kullanın.
2. Biyogüvenlik kabininde, paslanmaz çelik bir spatula ile donmuş tüpten 1 mL donmuş malzeme alın ve adım 3.5'te hazırlanan bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
3. Kültürleri 37 ° C'lik bir inkübatörde 24 saat inkübe edin.

4. LB-Lennox (Agarlı Et Suyu) Petri Kaplarının Hazırlanması

1. İki tablet LB-Lennox'u (agarlı et suyu) 100 mL su ile 100 mL'lik bir laboratuvar şişesinde çözün.
2. İçeriği bir PTFE manyetik karıştırma çubuğuyla 20 dakika karıştırın ve ardından sıkıca kapatın.
3. İçeriği 120 °C'de 10 dakika otoklavlayın.
4. Biyogüvenlik kabininde, 100 mL çözeltiyi 4 Petri kabına elle ayırın ve her birinin ~25 mL almasını sağlayın. Çözeltiyi oda sıcaklığına soğumaya bırakın.

5. Monoklonal Bakterilerin Hazırlanması

1. Biyogüvenlik kabininde, sırasıyla adım 2.6, #1, #2 ve #3'te hazırlanan üç şişeyi etiketleyin.
2. Adım 3.3'te elde edilen bakteri süspansiyonunun 0.1 mL'sini şişe #1'e pipetleyin. Şişenin kapağını kapatın ve homojen bir çözelti elde etmek için elinizle 1 dakika sallayın.
3. Adım 5.2'de elde edilen bakteriyel sıvının 0.1 mL'sini şişe #2'ye pipetleyin. Şişenin kapağını kapatın ve homojen bir çözelti elde etmek için elinizle 1 dakika sallayın.
4. Adım 5.3'te elde edilen bakteriyel sıvının 0.1 mL'sini şişe #3'e pipetleyin. Şişenin kapağını kapatın ve homojen bir çözelti elde etmek için 1 dakika elle çalkalayın.
5. Şişe #3'teki sıvıyı, her biri 0,02 mL'lik bir hacim kullanarak adım 4.4'te hazırlanan 4 Petri kabına pipetleyin.
6. Adım 1.3'te hazırlanan cam boncukları, her kapta 4 boncuk olacak şekilde kullanılan 4 Petri kabına koyun.
7. Petri kaplarının kapaklarını kapatın ve 1 dakika boyunca elle sallayın.
8. Petri kaplarını ters çevirin ve 37 °C'lik bir inkübatörde 24 saat inkübe edin.

6. Monoklonal Bakterilerin Çoğalması

1. Adım 2.5'te hazırlanan 7 tüpü getirin.
2. Adım 5.8'de hazırlanan 4 Petri kabından elde edilen monoklonal bakterileri paslanmaz çelik bir spatula ile seçin ve ayrı ayrı 7 tüpe koyun.
3. 7 tüpü 37 °C'lik bir inkübatörde 24 saat bekletin.
4. Görsel kolorimetrik yöntemi kullanarak en büyük ışık saçılımına sahip olanı seçin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agar tabletleri ile LB (Lennox suyu)	Sigma-Aldrich	L7075 Serisi	Agarlı 50 mL et suyu için 1 tablet
LB (Lennox suyu)	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) tozu 1 kg
Dekstroz susuz	Nihon Shiyaku Reaktifi	PL 78695 Serisi	glikoz
50 mL santrifüj tüpü	Doğan	14-432-22
15 mL santrifüj tüpü	Doğan	14-959-53A
Laboratuvar şişesi 100 mL	Duran	21 801 24 5
Laboratuvar şişesi 500 mL	Duran	21 801 44 5
Paslanmaz çelik spatula	Kimya camı	CG-1981-10
PTFE Tek Kullanımlık Karıştırma Çubukları	Balıkçı	S68066 Serisi
Plastik Petri Kapları	Balıkçı	S33580A
Kuvöz	Müşteri yapımı	Özel yapım	40 °C'ye ısıtın veya 18 °C'ye soğutun
Biyogüvenlik kabini	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	Bakterilerle ilgili tüm işlemler burada yapılır
Otoklav	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Taipei Şehri, Tayvan, ROC	TM-329 Serisi	10 dakika boyunca 120 °C'ye ısıtın