Metal İndirgeyici Bakteriler Kullanılarak Metal Oksit Mikrokapsüllerin Sentezi

Özet

Kaynak: Lin, P., ve diğerleri. Bakteriyel mineral atılımı yoluyla sodyum tungstat ve sodyum molibdat mikrokapsüllerinin sentezlenmesi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, metal indirgeyici bakterileri metal iyonları ile kültürleyerek sert metal oksit mikrokapsüllerinin sentezlenmesi prosedürünü ve ardından sonikasyon, santrifüjleme ve etanol yıkama yoluyla sıralı saflaştırmayı göstermektedir.

Protokol

DİKKAT: Deneyi gerçekleştirmek için lateks eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü kullanın. Biyogüvenlik kabinini her kullandığınızda, kabin fanını açın ve kabin kapağını yarı kapalı tutun.

1. Cam Boncukların Hazırlanması

1. 100 mL'lik bir laboratuvar şişesine 3 mm çapında 100 cam boncuk yerleştirin ve ardından sıkıca kapatın.
2. İçeriği 120 °C'de 10 dakika otoklavlayın.
3. Şişeyi oda sıcaklığına soğumaya bırakın, ardından biyogüvenlik kabinine yerleştirin.

2. Lizojeni Suyunun (LB) Hazırlanması

1. 8 g LB-Lennox et suyu tozunu 500 mL'lik bir laboratuvar şişesinde 400 mL su ile eritin.
2. İçeriği bir PTFE (Politetrafloroetilen) manyetik karıştırma çubuğuyla 20 dakika karıştırın ve ardından sıkıca kapatın.
3. İçeriği 120 °C'de 10 dakika otoklavlayın.
4. Çözeltiyi oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
5. Bir pipet kullanarak et suyunu biyogüvenlik kabininde sekiz adet 15 mL'lik santrifüj tüpüne (her biri 12,5 mL) ayırın.
6. Kalan suyu biyogüvenlik kabininde üç adet 100 mL'lik laboratuvar şişesine (her biri 100 mL) ayırın. Üç şişeyi sıkıca kapatın ve biyogüvenlik kabininde saklayın.

3. Shewanella yosunu kültürü

1. Derin dondurulmuş dondurularak saklanmış suşu kullanın.
2. Biyogüvenlik kabininde, paslanmaz çelik bir spatula ile donmuş tüpten 1 mL donmuş malzeme alın ve adım 3.5'te hazırlanan bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
3. Kültürleri 37 ° C'lik bir inkübatörde 24 saat inkübe edin.

4. LB-Lennox (Agarlı Et Suyu) Petri Kaplarının Hazırlanması

1. İki tablet LB-Lennox'u (agarlı et suyu) 100 mL su ile 100 mL'lik bir laboratuvar şişesinde çözün.
2. İçeriği bir PTFE manyetik karıştırma çubuğuyla 20 dakika karıştırın ve ardından sıkıca kapatın.
3. İçeriği 120 °C'de 10 dakika otoklavlayın.
4. Biyogüvenlik kabininde, 100 mL çözeltiyi 4 Petri kabına elle ayırın ve her birinin ~25 mL almasını sağlayın. Çözeltiyi oda sıcaklığına soğumaya bırakın.

5. Monoklonal Bakterilerin Hazırlanması

1. Biyogüvenlik kabininde, sırasıyla adım 2.6, #1, #2 ve #3'te hazırlanan üç şişeyi etiketleyin.
2. Adım 3.3'te elde edilen bakteri süspansiyonunun 0.1 mL'sini şişe #1'e pipetleyin. Homojen bir çözelti elde etmek için şişenin kapağını kapatın ve elinizle 1 dakika sallayın.
3. Adım 5.2'de elde edilen bakteriyel sıvının 0.1 mL'sini şişe #2'ye pipetleyin. Homojen bir çözelti elde etmek için şişenin kapağını kapatın ve elinizle 1 dakika sallayın.
4. Adım 5.3'te elde edilen bakteriyel sıvının 0.1 mL'sini şişe #3'e pipetleyin. Homojen bir çözelti elde etmek için şişenin kapağını kapatın ve 1 dakika elle çalkalayın.
5. Şişe #3'teki sıvıyı, her biri 0,02 mL'lik bir hacim kullanarak adım 4.4'te hazırlanan 4 Petri kabına pipetleyin.
6. Adım 1.3'te hazırlanan cam boncukları, her kapta 4 boncuk olacak şekilde kullanılan 4 Petri kabına koyun.
7. Petri kaplarının kapaklarını kapatın ve 1 dakika boyunca elle sallayın.
8. Petri kaplarını ters çevirin ve 37 °C'lik bir inkübatörde 24 saat inkübe edin.

6. Monoklonal Bakterilerin Çoğalması

1. Adım 2.5'te hazırlanan 7 tüpü getirin.
2. Adım 5.8'de hazırlanan 4 Petri kabından elde edilen monoklonal bakterileri paslanmaz çelik bir spatula ile seçin ve ayrı ayrı 7 tüpe koyun.
3. 7 tüpü 37 °C'lik bir inkübatörde 24 saat bekletin.
4. Görsel kolorimetrik yöntemi kullanarak en büyük ışık saçılımına sahip olanı seçin.

7. LB-Lennox Et Suyunun Glikoz ve Tuzla Hazırlanması

1. 10 mL'lik bir laboratuvar şişesine 10 g LB-Lennox suyu, 10 g NaCl ve 500 g glikoz koyun. Hacim 450 mL'ye ulaşana kadar su ekleyin.
2. İçeriği bir PTFE manyetik karıştırma çubuğu ile 20 dakika karıştırın.
3. İçeriği 120 °C'de 10 dakika otoklavlayın.

8. Sodyum Tungstatın Hazırlanması

1. 16.5 g Sodyum Tungstat Na₂WO_{4.2H 2}O'yu paslanmaz çelik bir spatula ile 100 mL'lik bir laboratuvar şişesine koyun. Hacim 50 mL'ye ulaşana kadar su ekleyin.
2. İçeriği bir PTFE manyetik karıştırma çubuğu ile 20 dakika karıştırın.
3. İçeriği 120 °C'de 10 dakika otoklavlayın.
4. Biyogüvenlik kabininde, 1 μm gözenekli vakumlu fiberglas filtre ile süzüntü elde edin.

9. LB'nin Glikoz, Tuz ve Sodyum Tungstat ile Hazırlanması

1. Biyogüvenlik kabininde, adım 8.4'te elde edilen süzüntüyü adım 7.3'te hazırlanan glikoz ve tuz içeren çözeltiye elle dökün.
2. Biyogüvenlik kabininde, adım 9.1'deki 500 mL'lik elde edilen çözeltiyi bir pipetle 10 x 50 mL'lik santrifüj tüplerine ayırın.

10. Bakteri Kültürü

1. Biyogüvenlik kabininde, adım 6.4'te hazırlanan sıvıyı alın ve bir pipetle adım 9.2'de hazırlanan 10 test tüpüne ayırın ve her tüp 0.05 mL alır.
2. 10 tüpü 37 °C'lik bir inkübatörde 120 saat inkübe edin.

11. BME minerallerinin hasadı

1. Adım 9.2'deki 10 tüpün her birini 20 KHz'de 1 saat boyunca 150 W ile ultrasonikleştirin.
2. Tüpleri 1 saat boyunca 2.025 x g'da santrifüjleyin.
3. Tüplerdeki berrak sıvıyı bir pipetle çıkarın, su ekleyin ve ardından 11.1 ve 11.2 adımlarını bir kez daha tekrarlayın.
4. Tüplerdeki berrak sıvıyı bir pipetle çıkarın, alkol ekleyin ve ardından 1 saat boyunca 150 W ile 20 KHz'de ultrasonikleştirin.
5. Tüpleri 1 saat boyunca 2.025 x g'da santrifüjleyin.
6. 11.4 ve 11.5 adımlarını bir kez daha tekrarlayın
7. Tüplerdeki berrak sıvıyı bir pipetle çıkararak BME minerallerini hasat edin; Daha sonra herhangi bir kurutma işlemi yapmadan tüpleri hemen kapatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agar tabletleri ile LB (Lennox) et suyu	Sigma-Aldrich	L7075 Serisi	Agarlı 50 mL et suyu için 1 tablet
LB (Lennox) suyu	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB (Lennox) tozu 1 kg
Dekstroz susuz	Nihon Shiyaku Reaktifi	PL 78695 Serisi	glikoz
Sodyum Tungstat	Nihon Shiyaku Reaktifi	PL 76050 Serisi	Na2WO4 · 2H2O
Sodyum klorür	Nihon Shiyaku Reaktifi	PL 68131 Serisi	NaCl
Etanol %99,5	Acros organikleri	AC615090040	CH3CH2OH
Su	Üniversitemizde üretilmiştir		deiyonize su
Otoklav	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., Taipei Şehri, Tayvan, ROC	TM-329 Serisi	10 dakika boyunca 120 °C'ye ısıtın
Merkezkaç	Rakam Sistemi Laboratuvar Sistemi, Yeni Taipei Şehri, Tayvan, ROC	DSC302SD	2025 x g'de santrifüj
-80 °C Buzdolabı	Panasonic	MDF-U3386S	Kriyoprezervasyon suşu derin dondurmak için kullanın
Ultrasonik Homojenizatör Sonikatör İşlemci Hücre Bozucu	Lenox	GÜÇ KAYNAĞI-150	frekans 20 KHz güç 150 W
Kuvöz	Müşteri yapımı	Özel yapım	40 °C'ye ısıtın veya 18 °C'ye soğutun
Karşılıklı çalkalama banyoları	Kingtech Bilimsel Co, Ltd	WBS-L
Dijital Karıştırma Sıcak Plakası	Corning	#6797-620D	PTFE manyetik karıştırma çubuğu ile kullanın
Biyogüvenlik kabini	Zong Yen co., LTD	ZYBH-420	Bakterilerle ilgili tüm işlemler burada yapılır
50 mL santrifüj tüpü	Doğan	14-432-22
15 mL santrifüj tüpü	Doğan	14-959-53A
Laboratuvar şişesi 100 mL	Duran	21 801 24 5
Laboratuvar şişesi 500 mL	Duran	21 801 44 5
Paslanmaz çelik spatula	Kimya camı	CG-1981-10
PTFE Tek Kullanımlık Karıştırma Çubukları	Balıkçı	S68066 Serisi
Plastik Petri Kapları	Balıkçı	S33580A
Shewanella yosunu	Yazar #3'ün izniyle	Yazar #3'ün izniyle