Isı Stresi Altındaki Sıçanlarda Yararlı Bakterilerin Bağırsak Mikrobiyal Translokasyonu Üzerine Etkisinin Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Sorokulova, I., ve diğerleri. Bacillus subtilis Suşu ile Sıçanlarda Isı Stresi Olumsuz Etkilerinin Önlenmesi. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, faydalı bakteriler veya fosfat tamponlu salin (PBS) ile ön işleme tabi tutulan ve bağırsak bariyeri bütünlüğünü değerlendirmek için ısı stresine maruz bırakılan sıçanları göstermektedir. Kontrol sıçanlarındaki çok sayıda koloninin aksine, tedavi edilen sıçanların karaciğerinden daha az bağırsak kaynaklı bakteri kolonisi, sağlam bir epitel bariyeri ve minimal bakteriyel translokasyon gösterir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Deneysel Tasarım

1. Hayvanların tedavisine 2 günlük iklimlendirmeden sonra oral gavaj ile başlayın. Oral gavaj iğnesi ile bir şırınga kullanın. 16 sıçanı iki gün boyunca günde iki kez Bacillus subtilis BSB3 süspansiyonu (sıçan başına 1 ml) ile tedavi edin (B. subtilis grubu). 16 sıçanı fosfat tamponlu salin, PBS (sıçan başına 1 ml), iki gün boyunca günde iki kez (PBS grubu) ile tedavi edin (Şekil 1).
2. Tedaviden sonra her grubu alt gruplara ayırın (grup başına 8 sıçan): Grup 1-kontrol (PBS/stres yok), Grup 2-B. subtilis (B. subtilis /stres yok), Grup 3-stres (PBS/ısı stresi) ve Grup 4- B. subtilis + stres (B. subtilis/ısı stresi).
3. Elektronik bir dijital termometre kullanarak her sıçanın rektal sıcaklığını ölçün. Grup 1 ve 2'deki sıçanları 25 dakika oda sıcaklığında tutun. Grup 3 ve 4'teki hayvanları 25 dakika boyunca 45 °C ve %55 bağıl nemde bir iklim odasına yerleştirin.
4. Daha sonra, elektronik bir dijital termometre kullanarak tüm gruplardaki her sıçanın rektal sıcaklığını ölçün. Tüm hayvanları 4 saat oda sıcaklığına koyun.
5. Sıçanları sızdırmaz bir anestezi kavanozunda izofluran (% 2 - 4) ile uyuşturun ve sıçanlar derinlemesine uyuşturulana kadar gözlemleyin (ayak parmağı sıkışmasına yanıt yokluğu). Giyotinle hızlı bir şekilde başlarını keserek sıçanlara ötenazi yapın.
6. Serum elde etmek için her sıçandan (15 - 16 ml) apirojenik pipetlerle gövde kanını apirojenik tüplere toplayın ve mikroskobik inceleme için hemen bir pipetle kan örnekleri (her sıçandan 7 μl) alın.
7. Pıhtılaşmayı sağlamak için kanlı tüpleri en az 30 dakika buzdolabına koyun. Tüpleri 20 °C'de, 7.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve serumu bir pipetle hızla çıkarın. Her sıçandan elde edilen serumu 50 μl hacimlere ayırın ve tahlilden başlayana kadar -20 °C'de saklayın.

2. Cerrahi Prosedür

1. Karkasın alt tarafındaki karın ve göğüs kafesindeki tüm kürkleri elektrikli makasla kesin/düzeltin. Karkası steril bir dolaba yerleştirin ve karkasın traşlanmış yüzeyine %70 alkol uygulayın.
2. Karnın orta hat kesisini oluşturmak için steril bir neşter kullanın. Steril cımbız kullanarak her sıçandan karaciğeri, mezenterik lenf düğümlerini, dalağı ve ince bağırsağı çıkarın.

3. Bakteriyel Translokasyon Analizi

1. Her bir karaciğer, mezenterik lenf düğümleri ve dalak örneğini önceden tartılmış steril tüplere yerleştirin ve tartın. Numunenin ağırlığını, numuneli bir tüpün ağırlığı ile boş bir tüpün ağırlığı arasındaki fark olarak hesaplayın.
2. Numunenin 1:10 oranında seyreltilmesini (hacim başına ağırlık, a/h) elde etmek için tüpe steril PBS ekleyin ve homojen bir süspansiyon elde etmek için her numuneyi steril bir cam doku homojenizatörü ile homojenleştirin.
3. Steril PBS'de her numunenin seri seyreltmelerini (^10-1 ila ^10-4) yapın. Her dokunun tüm seyreltmelerinin 0.1 ml'sini MacConkey's ve %5 kanlı agar ve Brucella kanlı agarın yüzeyine hemin (0.005 g/L) ve K1 vitamini (0.01 g/L) plakaları ile plakalayın.
4. MacConkey ve %5 kanlı agar plaklarını aerobik olarak ve Brucella kanlı agar plaklarını anaerobik koşullar altında 37 ^°C'de inkübe edin.
5. Bir koloni sayacı kullanarak 24 saat sonra aerobik bakteri kolonilerini ve 48 saatlik inkübasyondan sonra anaerobik bakteri kolonilerini sayın. Sonuçları bir gram dokudaki koloni oluşturan birimlerin (CFU) sayısı olarak ifade edin.

Sonuçlar

Şekil 1. Çalışma Tasarımı. İki grup sıçan (her grupta 16 sıçan) günde iki kez Bacillus subtilis BSB3 (B. subtilis grubu) veya PBS (PBS grubu) ile oral gavaj ile tedavi edildi. 3. günde, her grup, her grupta 8 sıç...

Malzemeler