Bacillus subtilis Sporlarının Üretimi ve Aerosol Bazlı Birikimi

Özet

Kaynak: Fuchs, F.M., vd. Düşük Basınçlı Plazma Sterilizasyonunun Bacillus subtilis Sporlarının Hayatta Kalması Üzerindeki Zararlı Etkilerinin Canlı Hücre Mikroskobu Kullanılarak Araştırılması. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, spor çimlenmesinin, canlılığının veya stres tepkisinin mikroskopi tabanlı analizi gibi aşağı akış uygulamalarına olanak tanıyan, tek tip bir tek tabaka oluşturmak için Bacillus subtilis sporlarının üretimini, saflaştırılmasını ve aerosol bazlı biriktirilmesini göstermektedir.

Protokol

1. Bacillus subtilis Spor Üretimi ve Saflaştırılması

1. Spor üretimi için, uygun antibiyotiklerle desteklenmiş ilgili B. subtilis suşunun 5 mL'lik bir gece kültürünü 200 mL çift mukavemetli sıvı Schaeffer sporülasyon ortamına aktarın (litre başına 16 g besin suyu, KCl (potasyum klorür) 2 g, 0.5 g MgSO₄*7 H₂O (magnezyum sülfat heptahidrat), 2 mL 1 M Ca(NO₃₎₂ (kalsiyum nitrat), 2 mL 0.1 M MnCl₂ *• 4 H₂O (manganez klorür tetrahidrat), 2 mL 1 mM FeSO₄ (demir sülfat), 2 mL %50 (a/h) glikoz18) ve 37 °C'de 72 saat boyunca kuvvetli havalandırma ile veya kültürün > %95'i sporlanana kadar yetiştirin. Aşağıdaki suşların sporları kullanılır: B. subtilis PY79 (vahşi tip) B. subtilis PY79ΔrecA::neo (DNA onarım proteini RecA eksikliği) B. subtilis PY79 recA-yfp::cat (RecA sarı floresan protein [YFP] ile kaynaşmıştır).
2. Sporları 50 mL'lik tüplerde 3.000 x g'da 15 dakika santrifüjleme ile toplayın ve numuneleri steril damıtılmış H₂O kullanarak tekrarlanan yıkama adımlarıyla (15 defaya kadar) saflaştırın ve faz kontrast mikroskobu ile saflık ve çimlenme durumunu kontrol edin. Spor süspansiyonlarının faz parlaklığında sporlardan (%> 99) oluştuğundan ve bitkisel hücreler (çubuklar), çimlenmiş sporlar (siyah/gri görünüm) ve hücre kalıntıları içermediğinden emin olun; aksi takdirde, daha fazla mikroskopi deneyi bozulabilir. İstenilen saflığa ulaşılana kadar numuneyi yıkayın.
3. LB (luria-bertani)-agar üzerine 50 μL 10 kat seri seyreltme kaplayarak spor titresini belirleyin (yani: 1:10 seyreltme için 30 μL numune + 270 μL steril su kullanın. CFU'yu (koloni oluşturan birimler) hesaplamak için belirli seyreltmeden 270 μL_H2O'ya 1:100 seyreltme vb. alın ve plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. CFU tayininden sonra, steril su ile konsantre ederek veya seyrelterek numuneyi mL başına 10⁹ spora ayarlayın.

2. Aerosol Biriktirilmiş Bacillus subtilis Sporlarının Numune Hazırlaması

NOT: Sporların birikmesi ve üst üste binmesi, tedavi sırasında gölgelenme etkilerine yol açabilir ve sonuçta sahte inaktivasyon kinetiğine neden olabilir. Bu sorunu en aza indirmek için, spor örneklerini bir aerosol biriktirme tekniği ile hazırlayın. Kısaca, yüksek hassasiyetli iki maddeli nozulu, basınçlı taşıyıcı gaz akışıyla uyum içinde sıvı çıkışını düzenleyen bir elektrikli zamanlayıcı ile kontrol edin (burada N₂ ). Enjekte edilen sıvı numunesini nitrojen gazı akışını kullanarak nozül çıkışından dağıtın.

1. Elektrikle çalışan aerosol püskürtme ünitesinin içine nozul ile aynı hizada sterilize edilmiş mikroskobik slaytlar (hayatta kalma kinetiği için) veya yuvarlak 25 mm'lik lameller (DNA onarım işlemlerinin floresan takibi için/cLSM; konfokal lazer tarama mikroskobu için) şeklinde bir numune taşıyıcı yerleştirin. Kullanılan spor konsantrasyonunun, istenen nihai konsantrasyonun yüz katına karşılık gelmesi gerekir.
2. 1 mL spor kültürünü nozul sıvısı girişine aktarın ve 1,3 bar basınçta 0,1 sn'lik püskürtme işlemini başlatın. Püskürtülen spor süspansiyonu (1 x 10⁷), mikroskobik slayt üzerinde, düzgün dağılmış bir spor tek tabakası oluşturmak için saniyeler içinde hızla kuruyan ince bir film oluşturur. İşlenmiş numune taşıyıcılarını oda sıcaklığında steril bir kapta saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İki madde nozulu (model 970-8)	Schlick	14,404	230 V, 50 Hz, D 4,484/8, 0,8 mm delik çapı
Luria Bertani Orta	Sigma Aldrich	70122-100G
Tüp konektörleri	Festo Belediyesi	Yok	G 1/8
Cam kaydıraklar	VWR	48300-026
Attoflor hücre odası	Menzel, Fisher Ref.	3406816	d=25 mm, yuvarlak
Magnezyum sülfat heptahidrat	Sigma Aldrich	13152
Kalsiyum nitrat	Sigma Aldrich	202967
Manganez klorür tetrahidrat	Sigma Aldrich	244589
Demir sülfat	Uygulama Kimyası	13446-34-9
Glikoz	Merck	215422
Potasyum klorür	Sigma Aldrich	P9541-500G
Besin Suyu (NB)	Merck	105443
Luria-Bertani (LB)	Merck	110283
96 kuyulu plaka	Termo Fisher	243656