Microcystis aeruginosa'nın Akış Sitometrisi Kullanılarak Canlılık Analizi

Özet

Kaynak: Chapman, I.J., ve diğerleri, Akış Sitometrisi Kullanarak Fotosentetik Bir Organizmada (Microcystis aeruginosa) Hücre Ölümünü Belirlemek için Moleküler Prob Optimizasyonu. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, floresan prob etiketlemesini fikosiyanin otofloresan ve prob sinyalinin akış sitometrik analizi ile birleştirerek canlı ve ölü Microcystis aeruginosa hücrelerini ayırt etme yöntemini göstermektedir.

Protokol

1. Moleküler Prob Hücre Alımının Optimizasyonu

1. M. aeruginosa kültürünün yarısını üstel bir aşamadan hasat edin ve onu 'canlı' bir kontrol olarak kullanın.
   NOT: Yüksek yoğunluklu bir kültürden doğrudan üstel bir faza seyreltilen numuneler, ilk gecikme / indüksiyon fazından aşılanan kültürlere kıyasla ölü hücre döngüsü yoluyla optimizasyon sonuçlarını etkileyebilir.
2. Diğer yarısını %70 etanol, numuneleri 60 ^oC'de 1 saat ısıtma, paraformaldehit veya %4 formaldehit gibi yöntemler kullanarak 30 dakika boyunca 'ölü' kontrol olarak hazırlayın. Numunelerin mikro ortamındaki değişiklikleri kontrol edin (örn. pH).
   NOT: M. aeruginosa'daki pozitif, ısıyla öldürülmüş, 'ölü' kontrol, fikosiyanin sinyallerindeki azalma ile 'canlı' bir numuneden ayırt edilir. Diğer yöntemlerle ölümlerin indüklenmesi aynı çıktıya neden olmayabilir ve türlere göre değişiklik gösterebilir.
3. Farklı oranlarda 'canlı' ve 'ölü' örnekler (örneğin, %0, %25, %50, %100) kullanarak karışık örnekler oluşturun.
4. Koloni oluşumunu vorteksleme veya sonikasyon ile ayrıştırın ve pH'ı kontrol edin.
5. Yeşil (floresan kanal 1 veya FL1, 530 ± 15 nm) ve turuncu (floresan kanal 2 veya FL2, 585 ± 20 nm) nükleik asit problarından floresan kaydedebilen dedektörlerin yanı sıra 488 nm'lik bir lazer seçin ve fikosiyanin sinyallerini ilgili dedektörü aracılığıyla kaydetmek için 640 nm lazer.
   NOT: DNA'ya bağlandığında, yeşil nükleik asit probu yaklaşık 504 nm'lik bir floresan uyarma dalga boyuna ve 523 nm'lik bir emisyon maksimumuna sahipken, turuncu nükleik asit probu 547 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve 570 nm'lik bir emisyon maksimumuna sahiptir. Her iki moleküler probu uyarmak için 488 nm'lik bir argon iyonu katı hal lazeri kullanılabilir, ancak yeşil bir lazer (547 nm'ye kadar) daha yüksek bir turuncu floresan üretecektir.
6. Başlangıç noktası olarak, moleküler probu üreticinin tavsiye ettiği konsantrasyonda %50 'canlı' ve %50 'ölü' kültüre sokun ve karanlıkta inkübe edin.
7. Yeni bir veri hücresi seçin, numuneyi arka plan gürültüsünü azaltacak eşikler ve tetikleyicilerle (FSC-H veya ileri saçılma yüksekliği, 80.000) numune giriş portunun (SIP) altına yerleştirin.
8. FSC-H ve SSC-H (yan saçılma yüksekliği) parametreleri ve üç histogram ile bir yoğunluk grafiği oluşturun. İlgili moleküler prob optik dedektör kanalını (FL1 veya 2) kullanan bir histogram, biri fikosiyanin emisyonlarını (floresan kanalı 4 yüksekliği veya FL4-H) ve diğeri FSC-H'yi kullanır, tümü log ölçeğinde.
9. M. aeruginosa örneklerini karanlıkta nükleik asit probları ile 60 dakikaya kadar inkübe edin ve çeşitli zaman noktalarında (1, 5, 10, 15, 30 ve 60 dakika) ayrı veri hücrelerine kaydedin.
   NOT: pH gibi parametreleri ayarlarken, belirli kimyasallardan kaynaklanan potansiyel reaksiyonlar için üreticilere danışın (test edilen nükleik asit probları için, DNA ile bağlanma azalacağından, bir tampon fosfat veya yüksek seviyelerde tek değerlikli veya iki değerlikli katyonlar içeremez).
10. İlgili floresan prob kanalı histogramında hedef organizmanın hücre boyutu için yalnızca FSC-H histogramını (320.000 - 1.500.000) içerecek bir yazılım kapısı uygulayın.
    NOT: Bu protokolde kullanılan konsantrasyonlar 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 ve 100 μM idi ve bu, M. aeruginosa numunesinin hacmini artırarak veya azaltarak veya nükleik probların ilk stok çözeltisi ile değiştirilebilir.
11. Floresan prob kanalında, histogramdaki en yüksek tepe noktasına (yeşil FL1-H, 240.000 - 1.650.000, turuncu FL2-H, 30.000 - 165.000) başka bir kapsayıcı yazılım kapısı uygulayın ve ardından bu pozitif prob floresansını yoğunluk grafiğine geçirin.
12. 3.1 - 3.11 adımlarını %100 "canlı", %100 "ölü" ve tüm karışık kültür numuneleri ile çalıştırın, moleküler prob konsantrasyonlarını (örneğin, x 0.1 ila x 10) ve/veya gerekirse sıcaklık ve pH seviyelerini ayarlayın.
13. Nükleik asit probları ile boyanmış hücrelerin toplam yüzdesini bulmak için pozitif moleküler prob floresan sinyallerinin sayısını 'ölü' hücrelerin orijinal hücre yoğunluğuyla (toplam FSC-H'nin yarısından veya %100 'ölü' kültürden alınan) karşılaştırın.
14. Spesifik olmayan boyama üretmeden hücre nükleik prob alımının en yüksek yüzdesi için en uygun protokolü bulmak için bunu her konsantrasyon içindeki her zaman periyodu için yapın (veriler parametrik değilse, Tek Yönlü varyans analizi, ANOVA veya Kruskal-Wallis tek yönlü varyans analizindeki araçları kullanın).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Siyanobakteriler Medya	Sigma-Aldrich	C3061-500ML Serisi	BG-11 Tatlı su konsantre çözeltisi (x50 seyreltme)
Dekontaminasyon Sıvısı	BD Biyolojik Bilimler	653155	Çıkışlar hızlı veya 66 μl/dak akış hızında saniyede 12 olaydan fazla olduğunda 2 dakika çalıştırın. Ardından 2 dakika kılıf H2O.
Akış Sitometresi	BD Biyolojik Bilimler	istek üzerine	BD Doğru C6
SYTOX Yeşil	Yaşam Teknolojileri	S7020 Serisi	Nükleik asit boyası – DMSO'da 5 mM çözelti
SYTOX Turuncu	Yaşam Teknolojileri	S11368	Nükleik asit boyası – DMSO'da 5 mM çözelti