Agar Kuyusu Difüzyon Testi Kullanılarak Nisin Varyantlarının Antimikrobiyal Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Nickling, J.H., et.al. Kanonik olmayan amino asitlerin seçici basınçla birleştirilmesiyle üretilen antimikrobiyal peptitler. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, nisin varyantlarının antimikrobiyal aktivitesini değerlendirmek için kullanılan bir agar kuyusu difüzyon testini göstermektedir. Membrana bağlı peptidaz NisP'yi eksprese eden Lactococcus lactis'in , E. coli'de üretilen nisin öncüllerini nasıl aktive ettiğini ve bunun sonucunda büyüme inhibisyon halelerine neden olduğunu gösterir. Bu halelerin boyutu, her bir nisin varyantının biyoaktivitesini yansıtır.

Protokol

1. Antimikrobiyal Aktivite Testi

1. GM17-agar plakalarının steril koşullarda hazırlanması
   1. %1 (a/h) glikoz (=GM17) ve 5 μg/mL kloramfenikol ile M17 et suyunda 30 °C'de plazmit pNG nisPT taşıyan L. lactis NZ9000 indikatör suşunun gece boyunca kültürünü hazırlayın.
   2. OD_600'ü ölçün, taze ortamı OD₆₀₀ = 0.1'e aşılayın ve OD₆₀₀ = 0.4-0.6'ya kadar inkübe edin. Ardından şişeyi buzun üzerine koyun.
      NOT: Her OD₆₀₀ ölçümü kültür hacmini tüketecektir. Her tahlil agar plakası için 1 mL bakteri kültürüne ihtiyaç duyulacağını unutmayın. Gerekirse, sıvı kültür hacmini buna göre ölçeklendirin.
   3. %1.5 agar için, bir cam ortam şişesinde 4.5 g agar tartın. 300 mL ddH₂O ekleyin, karıştırın ve otoklavlayın.
   4. 300 mL ddH₂O içinde 2x M17 et suyu (iki kez konsantre) hazırlayın ve otoklavlayın.
   5. 10 μg/mL kloramfenikol ve %2 glikoz içeren 25 mL 2x M17 et suyunu 1 mL L. lactis prekültürü (%4 v/v) ile karıştırın.
   6. 25 mL erimiş %1.5 agar ekleyin (taze otoklavlanmış veya mikrodalgada ısıtılmış).
      NOT: Bundan önce, şişeyi dokunulamayacak kadar soğumaya bırakın (yaklaşık 50 °C). L. lactis, yüksek sıcaklıklara duyarlı mezofilik bir organizma olduğu için bu gereklidir.
   7. Çözeltiyi büyük bir petri kabına dökün. Plakaları 10-15 dakika kurutun.
   8. Bir cam Pasteur pipetinin uçlarını alevle sterilize edin. Soğumasını bekleyin, ardından katılaşmış GM17-agarda delikler oluşturmak için geniş ucu kullanın.
2. Numune hazırlama
   1. 1 mL E. coli ekspresyon kültürlerini etiketli 1.5 mL'lik bir tüpe alın ve 7.000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Kalan ortamı aspire edin ve hücre peletini 500 μL Na-P (50 mM sodyum fosfat tamponu, pH 7.4, 0.5 M sodyum dihidrojen fosfat ve 0.5 M disodyum hidrojen fosfattan yapılmıştır) içinde yeniden süspanse edin.
   2. Örnekleri buz üzerinde sonikleştirin. Sonikatör probunun ucunu hücre süspansiyonuna batırın. Sonikatörü 3 dakika boyunca 1 s açık ve 5 s kapalı darbe ile% 30 genliğe ayarlayın.
   3. Pelet hücre kalıntılarına hücre lizatını 13.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı buz üzerinde yeni bir reaksiyon tüpüne aktarın.
   4. Hücre ekstraktı süpernatantlarını, hasat edilen hücre yoğunluğuna göre Na-P ile 1 mL OD₆₀₀ = 0.6'ya seyreltin ve normalleştirin.
3. Etkinlik testi
   1. Normalleştirilmiş her numuneden 40 μL'yi indikatör agar plakasının bir deliğine ekleyin (Şekil 1). Antibakteriyel kontrol bileşiği olarak 400 μg/mL'de kloramfenikol kullanın. Negatif kontrol olarak elüsyon tamponu kullanın. Tüm numuneler agara yayılana kadar bekleyin. Plakayı gece boyunca 30 °C'de inkübe edin.
   2. Düz yataklı bir tarayıcı veya dijital kamera kullanarak agar plakalarının fotoğraflarını çekin. Büyüme inhibisyonu halo boyutları elle veya ImageJ kullanılarak ölçülebilir.

Sonuçlar

Şekil 1. Prolin analogları ile SPI yoluyla üretilen nisin varyantları içeren hücre lizatlarının antimikrobiyal aktivite testi . Nisin varyantlarının rekombinant vahşi tip örneklerle karşılaştırılması. T...

Malzemeler