Kistik Fibrozis Akciğer Balgamını Ex Vivo Taklit Etmek için Yapay Balgam Besiyerinin Hazırlanması

Özet

Kaynak: Vieira, J., ve diğerleri. Ek oksijenin kistik fibroz hava yolu mikrobiyomu üzerindeki etkisini incelemek için bir modelin tasarımı ve geliştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, kistik fibroz akciğer balgamının viskozitesini, besin bileşimini ve pH'ını taklit eden yapay bir balgam ortamının hazırlanmasını göstermektedir. Ortaya çıkan ortam, ex vivo çalışmalar için fizyolojik olarak uygun bir platform sağlar.

Protokol

1. Yapay Balgam Ortamı Hazırlama

NOT: Burada listelenen miktarlar, 1 L nihai suni balgam ortamının üretimi içindir ve Malzeme Tablosunda listelenen spesifik reaktifleri varsayar. Aynı nihai ürünü sağlamak için sayılar diğer hacimler için veya farklı reaktiflerin kullanımı için ayarlanmalıdır. Hedef konsantrasyonlar için Tablo 1'e bakın.

1. Yapay balgam kimyasal karışımı (ASCM)
   NOT: ASCM, nihai orta hacmin %25'ini oluşturur. Rafa dayanıklıdır ve toplu olarak veya önceden hazırlanabilir. Daha sonra kullanılmak üzere hazırlanıyorsanız, kimyasal karışımı otoklavlayın ve oda sıcaklığında güvenli bir şekilde saklayın.
   1. Bileşen kimyasal stok çözeltilerini karıştırın.
      1. 1 M NaCl stoğu hazırlayın: Bir litre steril suya 58,44 g NaCl ekleyin.
      2. 1 M KCl stoğu hazırlayın: Bir litre steril suya 74,55 g KCl ekleyin.
      3. 1 M MgSO₄ stoğu hazırlayın: Bir litre steril su için 246,47 g MgSO₄·7H₂O veya bir litre steril su için 120,37 g susuz MgSO₄ ekleyin.
      4. 1 M glikoz stoğu hazırlayın: Bir litre steril suya 180.16 g glikoz ekleyin.
   2. Kimyasal stok çözeltilerinin yanı sıra 250 mL'lik boş bir şişeyi otoklavla sterilize edin. Otoklavlama adımlarını 30 dakika boyunca en az 121 °C ve 15 PSI standart değerlerde gerçekleştirin.
   3. Boş 250 mL'lik şişeye 80,59 mL steril su ekleyin.
   4. Karışıma 152.30 mL 1 M NaCl stoğu ekleyin.
   5. Karışıma 15,8 mL 1 M KCl stok ekleyin.
   6. Karışıma 610 μL 1 M MgSO₄ stoğu ekleyin.
   7. Karışıma 700 μL 1 M glikoz stoğu ekleyin.
2. Yapay balgam müsin karışımı (ASMM)
   NOT: ASMM, nihai orta hacmin %50'sini oluşturur. Son orta parti ile aynı gün hazırlandığından emin olun.
   1. Boş 1 L'lik bir şişeye 450 mL steril su ekleyin.
   2. Şişeye 50 mL 10x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ekleyin.
   3. Şişeye tek kullanımlık bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin.
   4. PBS içeren şişeyi ve karıştırma çubuğunu otoklavlayın.
   5. 10 g müsin tozunu ölçün ve PBS'ye ekleyin.
   6. Ön karıştırma için şişeyi kuvvetlice çalkalayın.
   7. Şişeyi manyetik karıştırıcılı bir sıcak plakaya yerleştirin. Isıyı orta-yüksek olarak ayarlayın, 50 °C'yi hedefleyin ve karıştırma hızını 1100 rpm'ye ayarlayın. Çubuğun mıknatıstan uçmaması için hızı kademeli olarak artırın.
      1. 15 dakika ısınmaya ve karıştırmaya bırakın.
      2. Şişeyi ısıya dayanıklı eldivenlerle alın. Müsin tozunun çözeltiden çöküp çökmediğini kontrol etmek için gözlemleyin.
      3. Müsin tozu tamamen çözülmemişse, şişeyi tamamen eriyene kadar 5 dakikalık aralıklarla ısıya/karıştırıcıya geri koyun.
   8. Müsin karışımının oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
3. Yapay balgam biyolojik karışımı (ASBM)
   NOT: ASBM, nihai orta hacmin %25'idir. Son orta parti ile aynı gün hazırlayın ve diğer karışımlardan farklı olarak bileşenlerini herhangi bir ısıya maruz bırakmayın.
   1. 100x vitamin stoğunu 4 °C'lik bir buzdolabında veya buz üzerinde çözdürün. ​
      NOT: Donma/çözülme döngülerinin sayısını en aza indirmek için vitamin stoğunu 10 mL'lik alikotlara önceden porsiyonlayın.
   2. Otoklavlanmış 250 mL'lik boş şişeye 124,24 mL steril su ekleyin.
   3. Karışıma 25.76 mL 50x esansiyel amino asit stoğu ekleyin.
   4. Karışıma 80.14 mL 100x esansiyel olmayan amino asit stoğu ekleyin.
   5. Karışıma 10 mL (çözülmüş) 100x vitamin stoğu ekleyin.
   6. Karışıma 1 mL 1000x eser metal stoğu ekleyin.
   7. Karışıma 8.33 mL %30 yumurta sarısı emülsiyonu ekleyin.
   8. Karışıma 400 μL 10 g/L ferritin stoğu ekleyin.
   9. Çözeltiyi elle çalkalayarak iyice karıştırın.
4. Yapay balgam ortamı (ASM)
   1. ASMM içeren 1 L'lik şişeye 250 mL ASCM ekleyin.
   2. Orta boy şişeye 250 mL ASBM ekleyin.
   3. Dar aralıklı bir pH kağıdında 6,3 pH'a ulaşmak için ortamı bazik MOPS tamponu (1 M) ile titre edin. Titrasyondan önce ortam karışımı çok asidik olacaktır.
   4. Elde edilen suni balgam ortamını filtrasyona hazır olana kadar 4 °C'de soğutun.
   5. Filtrasyon işlemini başlatmak için, 200 mL filtrelenmemiş suni balgam ortamını 0,22 μm gözenek boyutu filtreli bir vakumlu filtrasyon sistemine aktarın.
   6. Filtrasyon sistemini vakum pompasına bağlayın, vakum pompasını açın, 70 mbar'a ayarlayın ve ardından hazneyi 4 °C'de soğuk bir odada 90 rpm'de çalkalayan bir yörüngesel çalkalayıcıya yerleştirin.
      1. Kayda değer bir miktar filtrelendiği için ilave 150 mL ortam ekleyin. 1 L ortamın tamamen süzülmesi 1-2 gün sürer.
      2. Tüm ortam filtrelenene kadar ek bölmelerle tekrarlayın.
         NOT: Müsin zamanla filtreyi tıkadığından, aynı 0,22 μm'lik filtreden 350 mL'den fazla ortamı filtrelememeye çalışın.
   7. Filtrelenmiş suni balgam ortamını kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de soğutun. En iyi sonuçlar için ASM'yi hazırlıktan sonraki bir ay içinde kullanın.

Tablo 1: Literatür taramasından elde edilen yapay balgam ortamı tarifi. (Sütun 1) Yapay balgam ortamının formülasyonundaki reaktifler ve anahtar değerler. (Sütun 2-7) Mevcut literatürden tariflerin karşılaştırılması. (Sütun 8-9).

Sütun 1		Sütun 2	Sütun 3	Sütun 4	Sütun 5	Sütun 6	Sütun 7	Sütun 8	Sütun 9
Değer		Comstock	Kirchner	Sriramulu	Poyraz	Flynn	Gallagher'ın	Lai	Kaynak
Müsin		%2 w/v	%0,5 w/v	%0,5 w/v	-	%1 w/v	%2 w/v	%1 w/v	Flynn
Sodyum klorür		85,5 milyon metre	85,5 milyon metre	85,5 milyon metre	66,6 milyon	89,8 milyon	85,5 milyon metre	152,3 milyon	Lapierre
Potasyum klorür		29,5 milyon	29,5 milyon	29,5 milyon	15,8 milyon	-	2,95 milyon	15,8 milyon	Poyraz
Magnezyum sülfat		-	-	-	0,6 milyon	1 milyon	1 milyon	0,61 milyon dakika	Poyraz
Demir sülfat		-	-	-	0,0036 milyon metre	-	-	-	-
Amonyum klorür		-	-	-	2,3 milyon	60 milyon dakika	-	-	-
Monopotasyum Fosfat		-	-	-	2,5 milyon	60 milyon dakika	-	-	-
Glikoz		-	-	-	3,2 milyon	13 milyon	40 milyon	0,7 milyon	Sambeek
Laktat		-	-	-	9 milyon dakika	-	-	-	-
Esansiyel Amino Asitler		14,45 kat	0,25 g/L	0,25 g/L	Asit Başına	0,5 kat	0,375 kat	1,29 kat	Poyraz
Esansiyel Olmayan Amino Asitler		28,9 kat	0,25 g/L	0,25 g/L	Asit Başına	0,25 kat	0,5 kat	8,01 kat	Poyraz
Vitamin		-	-	-	-	-	1 adet	1 adet	Gallagher'ın
Eser Metaller		-	-	-	-	1 adet	1 adet	1 adet	Flynn
Yumurta sarısı		0.25%	0.25%	0.25%	-	-	0.25%	0.25%	Kirchner
Ferritin		0,0003 g/L	-	-	-	-	0,0004 g/L	0,0004 g/L	Gallagher'ın
Somon Sperm DNA'sı		1,4 g/L	4 g/L	4 g/L	-	-	1,4 g/L	-	-
DPTA Hakkında		-	-	0,0059 g/L	-	-	-	-	-
Ph		-	6.9	-	6.8	-	-	6.3	Lapierre
Depolama		0	4°	-	-	4°	4°	4°	Kirchner
Sterilizasyon		Otoklav	Filtre	Otoklav	-	Otoklav	Otoklav	Filtre	Kirchner

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BME Vitaminleri (100x) Solüsyonu	MilliporeSigma	B6891 Serisi	Konsantre ek vitamin çözeltisi.
Kıvırıcı, 30 mm	DWK Yaşam Bilimleri	224307	Alüminyum contaları serum şişelerine takmak için kıvırıcı.
D-(+)-Glikoz	MilliporeSigma	G7021 Serisi	Katı glikoz tozu (sağa döndürücü izomer).
Diyaframlı Pompa ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	Vakum filtrasyonu için vakum pompası.
Yumurta Sarısı Emülsiyonu	HiMedya	FD045 Serisi	Tuzlu su içinde %30 yumurta sarısının steril emülsiyonu.
At Dalağından Katyonize Edilmiş Ferritin	MilliporeSigma	F7879 Serisi	Ferritin (demir depolama proteini) çözeltisi.
FIREBOY plus Güvenlik Bunsen Brülörü	Integra Biyolojik Bilimler	144000	Kullanıcı arayüzü ve güvenlik özelliklerine sahip Bunsen brülör.
Hydrion pH Kağıdı (1,0–14,0)	Mikro Temel Laboratuvarı	94	1,0–14,0 aralığı için pH test kağıdı.
Hydrion pH Kağıdı (4,0–9,0)	Mikro Temel Laboratuvarı	55	4,0–9,0 aralığı için pH test kağıdı.
Hydrion pH Kağıdı (6,0–8,0)	Mikro Temel Laboratuvarı	345	6,0–8,0 aralığı için pH test kağıdı.
Hipodermik iğne-Pro EDGE güvenlik cihazı, 18 g	Smiths Tıbbi	401815	Emniyet kapaklı 18 G iğneler.
Hat İçi Basınç Göstergesi	MilliporeSigma	20469	Şişe basıncını izlemek için gaz basınç göstergesi.
Innova 42 İnkübasyonlu Çalkalayıcı	Eppendorf Belediyesi	2231000756	Kombinasyon inkübatör/orbital çalkalayıcı.
Luer-Lok Şırınga İğneli	Becton Dickinson	309580	Kombinasyon 3 mL şırınga ve 18 G iğne.
Luer Valf Çeşitleri	Dünya Hassas Aletler	14011	Gaz akış boruları için valfler.
LSE Yörünge Çalkalayıcı	ThermoFisher Bilimsel	6780-NP	Filtrasyon sırasında ortamı çalkalamak için orbital çalkalayıcı.
Magnezyum Sülfat Heptahidrat	MilliporeSigma	M2773 Serisi	Katı epsom tuzu (magnezyum sülfat heptahidrat).
Debimetreli Medikal Hava Tek Kademeli Regülatör	Batılı Şirketler	M1-346-15FM	15 L/dak sayaçlı hava akış hızı regülatörü.
MEM Amino Asitler (50x) Çözeltisi	MilliporeSigma	M5550 Serisi	Esansiyel amino asitlerin konsantre çözeltisi.
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler (100x) Çözeltisi	MilliporeSigma	M7145 Serisi	Esansiyel olmayan amino asitlerin konsantre çözeltisi.
Millex-GP Filtre, 0,22 μm	MilliporeSigma	SLMP25SS	0.22 μm polietersülfon membran steril şırınga filtresi.
Milli-Q Akademik	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Milli-Q steril su filtreleme sistemi.
MiniOX 3000 Oksijen Monitörü	MSA	814365	Gaz akışı oksijen yüzdesi monitörü.
MOPS tamponu (1 m, pH 9.0)	Boston Biyo Ürünleri	BBM-90	Medya pH'ını ayarlamak için MOPS tamponu.
Domuz Midesinden Müsin	MilliporeSigma	M2378 Serisi	Müsin (glikosile jel oluşturan protein) tozu.
Potasyum klorür	MilliporeSigma	P9541	Katı potasyum klorür tuzu.
PTFE Tek Kullanımlık Karıştırma Çubukları	ThermoFisher Bilimsel	14-513-95	Tek kullanımlık manyetik karıştırma çubukları.
PTFE İplik Contası Teflon Bant	VWR	470042-938	Gaz sistemi bağlantılarını güçlendirmek için teflon bant.
Q-Gard 2 Arıtma Kartuşu	MilliporeSigma	QGARD00D2	Milli-Q sistemi için arıtma kartuşu.
Yeniden Kullanılabilir Medya Saklama Şişeleri	ThermoFisher Bilimsel	06-423A	Kültür ortamını karıştırmak ve saklamak için şişeler.
Kauçuk Tıpa, 30 mm, Gri Bromobütil	DWK Yaşam Bilimleri	224100-331	Serum şişeleri için kauçuk tıpalar.
Kalıplanmış Dereceli Serum Şişesi, 500 mL	DWK Yaşam Bilimleri	223952	Kapalı kültür için cam serum şişeleri.
Küçük Çaplı Uzatma Seti	Braun Medikal	471960	Luer lock konnektörlü boru uzatması.
Sodyum klorür	MilliporeSigma	S3014 Serisi	Katı sodyum klorür tuzu.
Eser Metaller Karışımı, 1000x	ThermoFisher Bilimsel	NC0112668	Fizyolojik eser metallerin konsantre çözeltisi.
Astarsız Alüminyum Conta, 30 mm	DWK Yaşam Bilimleri	224187-01	Alüminyum contalar kauçuk tıpaların üzerine kıvrılmıştır.