Drosophila Sineklerinde Bağırsakla İlişkili Bakterilerin Koloni Oluşturan Birimlerinin Miktarının Belirlenmesi

Özet

Kaynak: Dodge, R., ve diğerleri. Drosophila mikrobiyomuna uygulanan 96 oyuklu plaka formatında hızlı koloni oluşturan birim sayımı. J. Vis. Uzm. (2023)

Bu video, seri seyreltme ve kaplama yaklaşımı kullanılarak Drosophila sineklerinde bağırsakla ilişkili bakterilerin koloni oluşturan birimlerinin (CFU'lar) miktarının belirlenmesini göstermektedir. Bağırsak bakterileri içeren homojenize sinek örnekleri seri olarak seyreltilir, agar üzerine kaplanır ve koloni büyümesine izin vermek için inkübe edilir. Plakaların görüntüleri daha sonra her noktadaki kolonileri hizalamak, bölümlere ayırmak ve saymak için yazılım kullanılarak analiz edilir ve böylece doğru CFU ölçümü sağlanır.

Protokol

1. Homojenleştirici sinekler 96 oyuklu bir PCR plakasında ayrı ayrı

1. Boncuk çırpıcı plakaları önceden hazırlayın.
   1. Boncuk ölçüm tepsisine 0,5 μm cam boncuk dökün ( Malzeme Tablosuna bakınız). Boncukları, tüm kuyucuklar dolu ve düz olacak şekilde tepsiye yayın ve ardından fazla boncukları kurtarmak için konik bir tüpe fırçalayın.
   2. Yarı etekli bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) plakasını (Malzeme Tablosuna bakınız) ölçüm tepsisine baş aşağı yerleştirin ve tepsideki girintiye oturtarak kuyucuklarla hizalayın. Ardından, boncukları aktarmak için hızlıca ters çevirin.
   3. PCR plaka yüzeyindeki fazla boncukları çıkarın ve folyo ile örtün. Tüm kuyucukların boncuk içerdiğinden emin olmak için PCR plakasını inceleyin. Tek bir kuyucuğa boncuk eklemek için gerekirse bir tartım kepçesi kullanın. Statik elektrik, boncukların plaka yüzeylerine yapışmasına neden oluyorsa, ölçüm tepsisinin ve PCR plakasının arkasını silin veya %70 etanol püskürtün.
   4. Alüminyum folyo ile kaplayın. Birçok plaka bu şekilde hazırlanabilir ve daha sonra otoklavlanarak daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. Kullanıma hazır olduğunda, 96 kanallı pipetleyiciyi kullanarak her bir oyuğa 100 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin ( bkz.
2. Mikrop kolonize sinekleri homojenizasyondan önce %70 etanol ile yüzey sterilize edin.
   1. Sinekleri 5 saniye boyunca %100_CO2 ile uyuşturun. Anestezi uygulanmış sinekleri şişeden küçük bir huni kullanarak 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın (Şekil 1A-2). Bu çalışmada, tüp başına tipik olarak 25 sinek eklenmiştir.
   2. Hemen tüpe ~1 mL %70 etanol püskürtün, tüpü kapatın ve 10 saniye boyunca ters çevirerek karıştırın. Ardından, herhangi bir sineği aspire etmemeye dikkat ederek etanolü bir P1000 pipetle aspire edin. Etanol ile bir kez daha, ardından steril PBS ile iki kez tekrarlayın (Şekil 1A-3).
3. Son PBS yıkamasından sonra, tüpü kapatın ve kapak tarafı aşağı bakacak şekilde, sineklerin kapağa girmesi için tezgaha birkaç kez sertçe vurun.
4. Tüpü açın ve forseps kullanarak sinekleri kuyucuklara dağıtın (Şekil 1A-4). Her kuyucuğa bir sinek yerleştirin (Şekil 1A-5). Sinekleri uyuşturmak için yükleme sırasında plakayı buz üzerinde tutun.
5. Plakayı Thermal Bond ısıyla yapıştırma folyosu kullanarak kapatın ( bkz.
   1. Öncelikle kuyucuklara yakın olan başıboş boncukları çıkarın çünkü bunlar folyo contada sızıntıya neden olabilir. Folyonun donuk tarafının plaka üzerinde aşağı doğru ve parlak tarafının ısıyla kapatıcıya doğru yönlendirildiğinden emin olun. Isı yalıtım malzemesini ( Malzeme Tablosuna bakınız) 5 saniye boyunca sıkıca bastırın (Şekil 1A-6). Folyoyu sabitlemek için el aplikatörü ile parlatın ( Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Kötü sızdırmazlık, numune kaybının bir nedenidir.
6. Plakayı plaka çalkalayıcıya sabitleyin. 5 dakika homojenize edin (Şekil 1A-7). Sızdırmazlık folyosundan sıvıyı çıkarmak için boncuk plakasını bir mini plaka döndürücüde ( Malzeme Tablosuna bakınız) 350 x g'da 30 saniye aşağı döndürün.
7. Kuyucuklardan sinek homojenat damlacıklarının sıçramaması için plakayı tutarken folyoyu çıkarın.

2. Sinek homojenatının seri seyreltilmesi ve CFU plakaları üzerinde lekelenmesi

1. Dört dikdörtgen de Man, Rogosa ve Sharpe (MRS) agar büyüme plakasını (Malzeme Tablosuna bakınız) biyogüvenlik kabinine yerleştirin ve kapaklarını çıkarın. Bu protokolde L. plantarum'un büyümesi için MRS agar kullanıldı. Bu plakaları en az 10 dakika kurumaya bırakın (taze dökülmüşse veya depodan soğumuşsa 20 dakika).
   NOT: Plakalar ıslaksa, 96 oyuklu plakadan gelen damlacıklar birlikte hareket edecek ve sayımları bozacaktır.
2. 96 kanallı bir pipetleyici kullanarak steril 96 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 μL PBS ekleyerek üç seyreltme plakası hazırlayın. 96 kanallı pipetleyiciye bir raf P20 uç yükleyin.
3. Bölüm 1'de hazırlanan numune plakasından 11.1 μL homojenat aspire ederek 1:10 seyreltme yapın (Şekil 1A-8). Kuyucukların dibinden değil ortasından çektiğinizden emin olun çünkü sinek homojenatı ve cam boncuklar pipetleri tıkayacaktır. Boncuklar batar ve sinek parçacıkları yüzer ve orta tabakayı çoğunlukla temiz bırakır.
4. 11.1 μL'yi, kuyu başına 100 μL steril PBS içeren ilk seyreltme plakasına dağıtın. Seyreltme plakasını plaka çalkalayıcı üzerinde dakikada 600 devirde (rpm) 10 saniye tutun. Beş döngü boyunca yukarı ve aşağı pipetleyerek tekrar karıştırın. Birinci seyreltme plakasından ikinci seyreltme plakasına 11,1 μL aktarın ve sonraki iki seyreltme plakası için karıştırma adımlarını tekrarlayın.
5. Seyreltme serisi kaplamayı aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
   1. Büyüme plakalarını biyogüvenlik kabininden alın.
   2. En seyreltik plakadan başlayarak, 96 oyuklu pipetleyiciyi kullanarak her bir kuyucuktan agar plakalarına 2 μL yerleştirin (Şekil 1A-9).
      1. Pipetleyici kafasını yavaşça plakanın üzerine indirin, agara saplanmamaya dikkat edin. Plakayı dikkatlice inceleyin ve tüm noktaların dağıtıldığından emin olun; değilse, uygun konuma manuel olarak 2 μL ekleyin. Sıvı lekelerin hızla agara nüfuz ettiğini ve birlikte akmadığını kontrol edin.
      2. Lekeler birlikte çalışırsa, yeni bir taze agar plakası setini daha uzun süre kurutun ve lekelenmeyi yeniden yapın. Birden fazla plaka türü varsa (örneğin, farklı ortamlar veya antibiyotikli), bunları da tespit edin. Kalan çözeltiyi seyreltme plakasına geri dağıtın ve bir sonraki daha yüksek konsantrasyona geçin.
         NOT: Seyreltmeleri tespit ederken, pipet uçlarının içeriğinin önceki seyreltmeden temizlendiğinden emin olmak için bir sonraki seyreltmeyi beş kez karıştırın. Seyreltme plakaları, koloni sayımlarını etkilemeden 4 °C'de >8 saat saklanabilir.
6. Kalan seyreltme plakaları için kaplama işlemini adım 2.5'te açıklandığı gibi tekrarlayın, en seyreltikten en konsantreye doğru orijinal homojenatlı plakaya kadar ilerleyin.
7. Tüm sıvı agar içine emildiğinde, plakaları ters çevirin ve inkübatöre yerleştirin (Şekil 1A-10). Drosophila'dan Lactiplantibacillus ve Acetobacter için MRS ortamında optimum sıcaklık 30 °C'dir. Koloniler optimal boyuta ulaşana kadar inkübe edin: koloniler onları açıkça görebilecek kadar büyüktür, ancak birleşecek veya birbirlerinin büyümesine müdahale edecek kadar büyük değildir (optimal boyutun ölçülmesi için temsili sonuçlara bakın).
   NOT: Optimal büyüme koşulları gerinime bağlıdır ve ampirik olarak belirlenmelidir. Drosophila'dan Lactiplantibacillus için optimal inkübasyon süresi MRS agarda 26 saat ila 30 saattir. Drosophila'dan Acetobacter için, suşa bağlı olarak MRS'de optimal inkübasyon süresi 30 saat ila 48 saattir.
8. İnkübasyondan sonra, gerekirse plakaları sayıma hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.

3. Koloni oluşturan birimlerin (CFU'lar) miktarının belirlenmesi

1. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, plakaların fotoğrafını çekerek ve ardından otomatik yazılım kullanarak kolonileri sayarak CFU'ları ölçün. Plakalar 4 °C'de saklandıysa, plakalarda parlamaya neden olan yoğuşma olmaması için önce oda sıcaklığına ulaşmalarına izin verin.
2. Plakaları mantıklı bir sırayla düzenleyin ve fotoğraf çekerken bu sırada tutun - bu, dosyaları adlandırmayı kolaylaştırır. Tüm plakaları, A1 tüm plakalar için sol üst köşede olacak şekilde yönlendirin. Fotoğrafların karışmamasını sağlamak için A1 köşesinin benzersiz bir kimlikle etiketlenmesi önerilir. Her seyreltme serisini sırayla istifleyin.
3. Plaka kapağını çıkarın ve plakayı A1 doğru köşeye gelecek şekilde sahneye yerleştirin. Plaka fotoğraf kutusu, bu tepsi plakalarını fotoğraflamak için optimize edilmiştir ve floresan kolonilerini görüntülemek için aydınlatma ve filtre seçenekleri içerir.
4. Plakaları hayal edin. Plakalar arasında tutarlı bir pozlama seviyesi elde etmek için kamerayı ( Malzeme Tablosuna bakın) manuel ayarlarla kullanın. Perspektif bozulmasını en aza indirmek için uzun bir odak uzaklığı ayarı önerilir. Kamera sarsıntısından kaynaklanan bulanıklığı en aza indirmek için uzaktan deklanşör kullanarak fotoğrafı çekin.
5. Görüntüleri bir bilgisayara aktarın ve deney adı, ortam türü, seyreltme faktörü ve diğer ilgili ayrıntılar dahil olmak üzere yeniden adlandırın. Bazı işletim sistemleri ( Malzeme Tablosu'na bakın), Finder'da bir dizi dosyaya sağ tıklayarak kullanışlı bir toplu yeniden adlandırma özelliğine sahiptir.

4. Count-On-It paketini kullanarak otomatik koloni sayımı

1. ImageJ için sağlanan Croptacular eklentisini kullanarak görüntüleri kırpın. Bu eklenti, görüntüyü düzenli bir alt bölge dizisine bölmeye yardımcı olur (örneğin, 96 oyuklu bir plaka için 8 x 12). Alt bölgeler ayrı ayrı sayılacaktır.
   1. Niceleme için işlenecek görüntüleri bir klasörde düzenleyin. Plakaları ayırt eden dosya adlarını seçin, çünkü bu dosya adları her sayım kümesi için sütun başlıkları haline gelir. Bu klasör içinde "kırpılmış" ve "makbuzlar" adlı alt klasörler oluşturun.
   2. Croptacular'ı başlatın ve kırpmaya başlamak için Tamam'a tıklayın.
      NOT: Varsayılan ayarlar görüntülenir ve genellikle yeterlidir. Görüntünün çözünürlüğüne, aydınlatmaya, spot boyutuna vb. bağlı olarak temel parametrelerin ayarlanması faydalı olabilir.
   3. Görüntü zaten düzse, Boşluk tuşuna basmanız yeterlidir. Aksi takdirde, yatay olması gereken bir kenar boyunca bir çizgi çizerek görüntüyü düzeltin. Görüntü hala düz görünmüyorsa çizgiyi gerektiği kadar yeniden çizin.
   4. Ardından, sayımın yapılacağı alanın bir sınır kutusunu çizin. Tüm noktalar hücrelerinin içine girene kadar boyutu ve oranı ayarlayın. Izgarayı yenilemek için imleci sınır kutusunun dışına sürükleyin. Izgara iyi göründüğünde Boşluk tuşuna basın.
   5. Bir sonraki görüntünün otomatik olarak ilkiyle aynı açıya döndüğünden emin olun; Eklenti, tüm fotoğrafların aynı şekilde hizalandığını varsayar. Bu doğruysa, devam etmek için Boşluk tuşuna basın. Aksi takdirde, görüntüyü daha önce olduğu gibi düzeltin. Izgara ayrıca önceki görüntüyle aynı konumu hatırlar; ayarlayın ve ardından Space tuşuna basın.
2. ImageJ için sağlanan Count-On-It: Gridiron eklentisini kullanarak plakalardaki kolonileri numaralandırın.
   1. Gridiron> Count-On-It'i başlatın. Croptacular ile aynı ızgara ayarlarını kullanın. Kullanıcılar tüm klasörü toplu hale getirebilir, tek bir görüntüyü analiz edebilir veya mevcut görüntüden başlayabilir.
   2. Eşiği bir üst ve bir alt piksel yoğunluğu değerine göre ayarlayın. Tüm kolonileri seçmeye devam ederken eşiği mümkün olduğunca sıkı hale getirin. İdeal olarak, seçilen koloniler arasında bir miktar boşluk olacaktır, ancak yazılım blobları bir dereceye kadar bölümlere ayırabilir. Eşik tatmin edici olduğunda "Eylem Gerekli" iletişim kutusunda Tamam'ı tıklayın.
   3. Sonuçları incelemek için yakınlaştırın ve koloni sayılarına daha yakından bakın. İptal'e tıklamak eklentiyi iptal edecektir. Devam etmek için Tamam'ı tıklayın.
   4. İlk resimde, örneğin minimum koloni boyutunu değiştirmek için kurulum menüsüne devam etme veya geri dönme seçeneğinin verildiğinden emin olun. Toplu işleme devam etmek için Tamam'ı tıklatın. Ardından, makbuzları ve sonuçları tabloyu tutmak için bir klasör seçin. "Makbuzlar" klasörünü kullanın veya yeni bir klasör oluşturun.
   5. İlk görüntüden sonra, sonraki görüntüler varsayılan olarak önceki ayarlarla aynı eşiğe ayarlanacaktır. Bu ayarları kullanmak veya ayarları yapmak için Tamam'ı tıklatın. Fotoğraflar tutarlıysa ve ayar doğruysa, "İşlem Gerekli" iletişim kutusunda Tamam'ı tıklayın.
      NOT: Toplu işteki tüm görüntüler tamamlandığında, sonuç tablosu otomatik olarak makbuzlarla aynı klasöre kaydedilir.
   6. Yazılım tarafından üretilen sayım makbuzlarını gözden geçirin ve sayım hatalarını manuel olarak düzeltin. ImageJ eklentisi istatistiksel olarak doğrudur, ancak hatalar meydana gelir. Aykırı değerleri incelemek ve yanlış sayımları belirlemek için makbuzları kanıtlayın. Yazılım, CFU verilerini makbuzlarla aynı klasöre .csv dosyası olarak kaydeder.
3. Kullanıcının tercih ettiği yazılımı kullanarak verileri analiz edin.

Sonuçlar

Şekil 1: Kolonizasyon testi, 96 oyuklu bir plaka formatı kullanarak yüzlerce bireysel sinekteki CFU'ları ölçer. (A) Protokol bölümünde açıklandığı gibi kullanılan kolonizasyon tahliline ve yüksek verimli niceleme yöntemine res...

Malzemeler