İn Vitro Bitki-Mikrop Etkileşimlerini Taklit Etmek için Bakterilerin Bitki Kökü Sızıntıları ile Tedavisi

Özet

Kaynak: Yi, Y., ve diğerleri. Bitki-Mikrop Etkileşimi: Bacillus Mycoides'in Patates Kökü Eksüdalarına Transkripsiyonel Tepkisi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, bitki-mikrop etkileşimlerini incelemek için Bacillus mycoides kültürlerinin hazırlanmasını ve işlenmesini göstermektedir. Bir stok kültürünün çizilmesinden ve sıvı ortamda inkübe edilmesinden, bakterilerin çalkalama altında bitki kökü sızıntılarına maruz bırakılmasına kadar olan adımları özetlemektedir. İşlem, eksüdaların neden olduğu gen ekspresyonu değişikliklerinin müteakip analizi için bakteri hücrelerinin toplanması ve hızlı dondurulmasıyla sonuçlanır.

Protokol

1. Büyüyen Bakteriler

1. -80 °C'lik bir gliserol stoğundan bir B. mycoides suşunu bir Luria-Bertani (LB) agar plakasına çizin ve plakayı gece boyunca 30 °C'de inkübe edin.

2. Bir LB sıvı ortamını plakadan tek bir koloni ile aşılayın ve kültürü gece boyunca 200 rpm'de çalkalayan bir inkübatörde büyütün.
30 °C'dir.

2. Bakterilerin Tedavisi ve Örneklenmesi

1. Kök eksüdaları ile tedavi edilen bakterilerin büyüme eğrisini negatif bir kontrolle karşılaştırmak için, 50 mL LB sıvı ortam içeren bir dizi şişe hazırlayın. Tüm şişelere 0,5 mL gece bakteri kültürü ekleyin ve ortama sırasıyla %0, %5, %10 veya %15 (h/h) kök eksüdası veya steril deiyonize su ekleyin.

2. Kontrol olarak kök eksüdaları yerine deiyonize su içeren bir kültür kullanın. Daha sonra her 600 saatte bir₆₀₀ nm'de (OD 1) optik yoğunluğu ölçün. OD₆₀₀ değerlerini zamana karşı çizerek bir büyüme eğrisi oluşturun.

3. Bir gece boyunca seyreltin B. mycoides kültürü 90 mL önceden ısıtılmış LB ortamı ile 300 mL'lik bir şişede ~ 0.05'lik bir başlangıç OD 600'e kadar. Kültüre 10 mL kök eksüdası ekleyin ve 30 °C'de 1 saat inkübe edin.

4. Kontrol olarak 10 mL steril deiyonize su arıtımı kullanın. 4 °C'de 2 dakika boyunca 9.000 x g'da santrifüjleme yoluyla kültürden hücreleri toplayın. Süpernatanı atın ve peleti hemen sıvı nitrojen içinde dondurun, ardından kullanana kadar -80 °C'de saklayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sodyum hipoklorit	Sigma	CAS: 7681-52-9	%10-15 aktif klor
Luria-Bertani (LB) suyu
Kuluçka makinesi	New Brunswick Bilimsel	İnnova 4000
Spektrofotometre	Thermo Fisher Bilimsel	Genesys 20
Sıvı nitrojen
Cam boncuklar	Sigma	G8893 Serisi	0,5 μm
2,0 ml vidalı kapaklı tüp			RNase içermez
1,5 ml ve 2,0 ml Eppendorf tüp			RNase içermez
Merkezkaç	Eppendorf Belediyesi	5430