Metale Duyarlı Genlerin Rolünü İncelemek için Metal Sınırlı Bakteri Büyüme Testi

Özet

Kaynak: Maurakis, S., ve diğerleri. Metale Duyarlı Genlerin Karakterizasyonu ve Konakçı Ligandlardan Metal Edinimi için Neisseria gonorrhoeae'nin Metal Sınırlı Büyümesi. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, metale duyarlı genlerin rolünü incelemek için metal sınırlı bir bakteri büyüme testini göstermektedir. Metalden yoksun ortamda yetiştirilen vahşi tip ve mutant bakteriler, metal ligandı ile inkübe edilir ve büyümeleri bir plaka okuyucu kullanılarak izlenir. Metalin tükendiği koşullar altında, vahşi tip bakteriler, metal alımını ve büyümesini sağlayan bir yüzey reseptörü eksprese ederken, mutant bu reseptörden yoksundur ve bu da sınırlı büyümeye neden olur.

Protokol

1. Chelex ile İşlenmiş Tanımlanmış Ortam (CDM) Stok Çözeltilerinin Hazırlanması

1. Stok çözümü I
   1. Sodyum klorür veya NaCl (233.8 g), potasyum sülfat veya K₂SO₄ (40.0 g), amonyum klorür veya NH₄Cl (8.8 g), dipotasyum hidrojen fosfat veya K₂HPO₄ (13.9 g) ve monopotasyum dihidrojen fosfat veya KH₂PO₄ (10.9 g) deiyonize suda 1 L'lik bir nihai hacme kadar birleştirin.
   2. Çözeltiyi ve alikot'u 50 mL'lik konik tüplere filtreyle sterilize edin.
   3. -20 °C'de saklayın.
2. Stok çözümü II
   1. Tiamin hidroklorik asit veya HCl (0,2 g), tiamin pirofosfat-Cl (0,05 g), kalsiyum pantotenat (0,19 g) ve biyotini (0,3 g) %50 (hacim/hacim) etanol içinde 1 L'lik nihai hacme kadar birleştirin.
   2. 50 mL'lik konik tüplere ayırın ve -20 °C'de saklayın.
3. Stok çözümü III
   1. L-aspartat (4,0 g), L-glutamat (10,4 g), L-arginin (1,2 g), glisin (0,2 g), L-serin (0,4 g), L-lösin (0,72 g), L-izolösin (0,24 g), L-valin (0,48 g), L-tirozin (0,56 g), L-prolin (0,4 g), L-triptofan (0,64 g), L-treonin (0,4 g), L-fenilalanin (0,2 g), L-asparagin-H₂O (0,2 g), L-glutamin (0,4 g), L-histidin-HCl (0,2 g), L-metiyonin (0,12 g), L-alanin (0,8 g), 500 mL deiyonize suda L-lizin (0,4 g) ve indirgenmiş glutatyon (0,36 g).
   2. L-sistein (0.44 g) ve L-sistini (0.28 g) minimum hacimde (~1 mL) 1 M HCl'de çözün ve yukarıdaki amino asit çözeltisine ekleyin.
   3. Tüm partikül maddeler çözülene kadar çözeltinin pH'ını 10 N sodyum hidroksit (NaOH) ile ayarlayın. Nihai pH 10.0–11.0 olacaktır.
   4. Son hacmi deiyonize su ile 1 L'ye getirin.
   5. Çözeltiyi ve alikot'u 250 mL'lik hacimlere filtreleyin.
   6. -20 °C'de saklayın.
4. Stok çözümü IV
   1. Glikozu (200 g) deiyonize suda 1 L'lik bir nihai hacme kadar çözün.
      NOT: Glikozu çözmek için çözeltinin ısıtılması gerekebilir.
   2. Çözeltiyi filtreleyerek sterilize edin ve 50 mL'lik konik tüplere ayırın.
   3. -20 °C'de saklayın.
5. Stok çözümü V
   1. Hipoksantin (5.0 g), urasil (5.0 g) ve NaOH'yi (4.0 g) deiyonize suda 1 L'lik bir nihai hacme kadar birleştirin.
   2. Filtre sterilize edin ve 50 mL'lik konik tüplere ayırın.
   3. -20 °C'de saklayın.
6. Çözüm VI
   1. Deiyonize suda 1 M kalsiyum klorür dihidrat veya CaCl 2-2H2 O (147 g/L) çözeltisi hazırlayın. Filtre sterilize edin ve oda sıcaklığında (RT) saklayın.
7. Stok çözümü VII
   1. Deiyonize suda 1 M susuz magnezyum sülfat (_MgSO4) çözeltisi hazırlayın. Filtre sterilize edin ve RT'de saklayın.
8. Stok çözümü VIII
   1. Deiyonize suda 1 M sodyum bikarbonat (NaHCO₃ ) çözeltisi hazırlayın. Filtre sterilize edin ve RT'de saklayın.

2. 4x Steril Konsantre ve 1x CDM'nin Hazırlanması

NOT: Bu prosedür, metallerin çözeltilere sızmasını önlemek için asitle işlenmiş steril cam kaplarda veya plastikte gerçekleştirilmelidir.

1. Stok çözeltileri I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL) ve V'yi (20 mL) 20.0 g 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) ile birleştirin ve karıştırmak için karıştırın.
2. pH'ı 7,4'e ayarlayın, ardından son hacmi deiyonize su ile 500 mL'ye getirin.
3. Chelex-100 reçinesini 4x steril konsantreye eklemeden önce koruyucuları çıkarmak için 1 L deiyonize suda yıkayın. Bunu 1 L deiyonize suya 50 g reçine ekleyerek ve en az 1 saat karıştırarak yapın. Suyu vakumlu filtrasyonla çıkarın ve bu yıkanmış reçineyi adım 2.4 için kullanın.
4. 50 g reçine ekleyin ve tam olarak 90 dakika boyunca yavaşça karıştırın.
5. Reçineyi filtre sterilizasyonu ile çıkarın ve 4x steril konsantreyi 4 °C'de saklayın.
6. 1x çalışma konsantrasyonu CDM hazırlamak için, önce 4x konsantreyi steril deiyonize su ile seyreltin, ardından çözelti VI (500 mL 1x çözelti başına 125 μL), çözelti VII (500 mL başına 535 μL) ve çözelti VIII (500 mL başına 10 mL) ekleyin.
   NOT: Tüm stok çözeltileri zaten sterilize edilmiş olsa da, hazırlandıktan sonra 1x çözeltinin tekrar filtrelenerek sterilize edilmesi önerilir.

3. CDM Plakalarının Hazırlanması

NOT: Aşağıdaki tarif, tabaklar için 1 L ortam yapar, ancak bunları daha küçük hacimlerde hazırlamak en iyisidir. Her şey orantılı olarak küçülür.

1. Yıkanmış agaroz
   1. 50 g agarozu 1 litre deiyonize suda 1 saat karıştırarak eritin.
   2. Çözeltiyi bir santrifüj şişesine aktarın ve RT'de 15 dakika boyunca 1.200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice dökün ve atın.
   3. Agaroz peletini yeniden süspanse etmek için yeterli deiyonize su ekleyin, ardından 1 L'lik bir şişeye aktarın. Deiyonize su ile 1 L'lik son hacme getirin ve ardından adım 3.1.2'deki gibi karıştırın ve santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
   4. Peleti yeniden süspanse etmek için yeterli miktarda %100 etanol ekleyin, ardından yeni bir 1 L'lik şişeye aktarın. Etanol ile 1 L'lik son hacme getirin. Adım 3.1.2'deki gibi karıştırın ve santrifüjleyin.
   5. 3.1.4 adımını tekrarlayın.
   6. Yeniden süspanse etmek için agaroz peletine metanol ekleyin, ardından 1 L'lik bir şişeye aktarın. Metanol ile 1 L'lik son hacme getirin. Adım 3.1.2'deki gibi karıştırın ve santrifüjleyin.
   7. Adım 3.1.6'yı tekrarlayın.
   8. Yıkanmış agarozu alüminyum folyo ile kaplı bir tepsiye aktarın ve çeker ocakta kurumaya bırakın. Kuruduğunda, uzun süreli saklama için metal içermeyen bir kaba aktarın.
2. 750 mL deiyonize suya 10 gr yıkanmış agaroz ve 5 gr patates nişastası ekleyin.
3. Atmosfer basıncının 100 kPa üzerinde, 121 °C'de 30 dakika otoklavlayın.
4. Ortamın ~65 °C'ye soğumasını bekleyin, ardından 250 mL 4X CDM, 250 μL çözelti VI, 1.07 mL çözelti VII ve 20 mL çözelti VIII ekleyin.
5. İstenirse, plakaları dökmeden önce tercih ettiğiniz metalleri ekleyin. Metal içermeyen koşulları korumak için şelatörlerin eklenmesi gerekli değildir.
6. Petri kaplarına dökün ve katılaşmasına izin verin.

4. Neisseria gonorrhoeae'nin Metal Sınırlı Büyümesi

NOT: Çoğu uygulama için, CDM'nin aşılanmasından önce bakterileri metalle strese sokmak gerekli değildir. CDM'deki ilk ikiye katlama adımı ve ardından gelen seyreltme, gonokokların iç demir ve çinko depolarını tüketmek için yeterlidir. Bu nedenle, aşağıdaki prosedürün ilk iki adımı, Kellogg takviyesi I ve 12.5 μM ferrik nitrat (Fe(_NO3)₃) ile desteklenmiş Gonococcus (GC) orta bazından yapılmış agar plakaları kullanılarak gerçekleştirilir. Erken metal gerilimi isteniyorsa, çinko şelasyonu için Fe(NO₃)₃ içermeyen ve 5 μM TPEN (N,N,N',N'-tetrakis (2-piridilmetil) etilendiamin) veya demir şelasyonu için 10 μM deferoksamin içeren GC orta taban plakalarının hazırlanmasını öneririz. Tüm inkübasyon, %5_CO2 ile 37 °C'de gerçekleştirilir.

1. Deneyden iki gün önce, -2. günde, dondurucu stoklarından gonokokları GC orta plakalarına çizin ve 24 saatten fazla inkübe etmeyin.
2. -1. günde, tek kolonileri taze GC orta plakalarına çizin. Bunu büyüme deneyinden 14-16 saat önce yapmaya çalışın.
3. Deney gününde, asitle yıkanmış 125 mL'lik şaşkın bir tabanca şişesine 5-10 mL 1x CDM ekleyin ve bunu bir Klett kolorimetresini boşaltmak için kullanın.
4. CDM'yi sağlıklı, tek kolonilerden aşılamak için steril, pamuk uçlu bir çubuk kullanın. 20 Klett birimi hedefleyin.
   NOT: Bir Klett kolorimetresi mevcut değilse, bir spektrofotometre de uygundur. Klett birimleri için OD'ye evrensel bir dönüştürme formülü yoktur, ancak kaba bir kılavuz mevcuttur (https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales).
5. Yaklaşık bir kütle iki katına çıkana kadar (40 Klett birimi) 250 rpm'de çalkalayarak inkübe edin. Bu 1-2 saat arasında sürmelidir.
6. Bu noktada, kültürler, başlangıç kültür yoğunluğunun yarısına ulaşmak için yeterli hacimde CDM ilavesiyle tekrar seyreltilir (örneğin, 5 mL kültür 20 Klett biriminden 40 Klett birimine çıktıysa, 15 mL CDM onu 10 Klett birimine geri getirecektir) ve büyüme adım 4.5'te olduğu gibi devam edecektir. Geri seyreltme, metal işlemleri vb.'nin spesifik miktarı, sonraki uygulamalara bağlıdır. Aşağıda üç örnek veriyoruz

5. Metal Sınırlı Büyüme Deneyleri

NOT: Bu tahliller, önceden hazırlanmış büyüme ön karışımlarını tanımlar. Bu karışımların hazırlanması bölüm 6'da açıklanmıştır.

1. Adım 4.5'te kütlenin ikiye katlanması sırasında, 96 oyuklu bir mikroplakanın kuyucuklarını 10x ön karışımlarla ön işleme tabi tutun. Ek olarak, boşluk olarak kullanılmak üzere üç kuyu belirleyin. Bu kuyucuklara 10 μL 10x ön karışım ve 90 μL CDM ekleyin.
2. Yan kol şişelerindeki kültürler iki katına çıktıktan sonra, mikroplakadaki kullanılmayan bir kuyucuğa her kültürden 100 μL ekleyin ve optik yoğunluğu 600 nm'de (OD600) ölçün. Bu, bir spektrofotometredeki küvetlerle yapılabilir, ancak bir tahlilde daha fazla sayıda suş varsa, bu hantal hale gelebilir ve spektrofotometreniz doğrudan yan kol şişesinin kolundan ölçüm yapamadığı sürece genellikle tavsiye edilmez.
   1. OD'yi ölçerken, gonokokların canlı kalmasını sağlamak için şişeleri inkübatöre geri yerleştirin.
3. Kültürleri OD600 = 0.02'ye getirmek için gereken doğru seyreltme miktarını hesaplayın. 10x ön karışımların OD üzerinde ihmal edilebilir bir etkisi vardır ve hesaplamadan çıkarılabilir.
4. Kültürleri küçük kültür tüplerinde CDM ile seyreltin ve 10x ön karışımları plakada 1x'e seyreltmek için yeterli hacim ekleyin. Bir tabak ısıtıcısı varsa, çalışırken tabağı 37 °C'de tutun.
5. Plakayı bir plaka okuyucuda çalkalayarak 8-12 saat inkübe edin ve istenen aralıklarla OD600 ölçümleri alın.

6. Transferrin, S100A7 ve Kalprotektin'in Metal Yüklenmesi ve 10x Ön Karışımların Hazırlanması

NOT: CDM hazırlamada olduğu gibi, çözelti hazırlama için asitle yıkanmış cam veya plastik kullanın.

1. İnsan transferrinini başlangıç tamponunda (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO₃, pH = 8.4) 10 mg / mL'de (125 μM) çözün. S100A7 ve kalprotektin, 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-Merkaptoetanol ve 1 mM kalsiyum klorür veya CaCl₂, pH = 8.0'dan oluşan bir tampon içinde süspanse edilir.
   1. % 30 demir doygunluğu elde etmek için transferrin çözeltisine ferrasyon çözeltisi (100 mM sodyum sitrat, 100 mM NaHCO_3, 5 mM Demir (III) klorür heksahidrat veya FeCl_{3-6H 2}O, pH = 8.4) ekleyin (örneğin, 10 mg / mL'de yapılırsa 5 mL transferrin için 75 μL ferrasyon çözeltisi uygundur).
   2. %₂₅ doygunluk oluşturmak için S100A7'ye Çinko sülfat (ZnSO 4) veya proteine %50 molar oranda kalprotektin ekleyin (her protein molekülünün iki metal bağlanma bölgesi vardır). 100 μM S100A7 veya 50 μM ZnSO₄ içeren kalprotektin preparatları kullanılabilir.
   3. Her iki durumda da, metal yükleme için en az 1 saat uçtan uca karıştırmaya izin verin.
2. 4 L diyaliz tamponu hazırlayın (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO₃, pH = 7.4). Bunu iki ayrı 2 L hacme bölün ve birini 4 °C'ye yerleştirin.
3. Metal yüklü proteinleri bir şırınga kullanarak bir diyaliz kasetine ekleyin ve RT'de 4 saat boyunca ilk tampon hacmine karşı diyaliz yapın.
4. Kaseti ikinci tampon hacmine taşıyın ve gece boyunca 4 °C'de diyaliz yapın. Bu adımlardan sonra, bağlanmamış metaller çıkarılmalıdır.
   NOT: Diyalizden sonra protein konsantrasyonlarını belirlemek için bir bisinkoninik asit testi öneriyoruz.
5. Tek demir kaynağı olarak transferrin kullanımı için 10x transferrin premiksi kullanın.
   1. Bu ön karışımı, %30 insan Fe-transferrin ve sığır apo-transferrinini (demir yükleme adımı olmadan insan transferrini için tarif edildiği gibi 125 μM'de hazırlanır) fosfat tamponlu salin (PBS) içinde sırasıyla 75 μM ve 30 μM'ye seyrelterek hazırlayın. Pozitif kontrol ön karışımı, %30 Fe-transferrini 75 μM Fe(NO)₃ ile değiştirir ve negatif kontrol ön karışımı, yalnızca sığır apo-transferrini tutarak ilave edilen demiri atlar. Büyüme testinde, bu konsantrelerin 10 μL'sini 90 μL kültürle seyreltin. Nihai konsantrasyonlar 7.5 μM %30 insan Fe-transferrin ve 3 μM sığır apo-transferrin'dir.
6. S100A7 için transferrin 10x ön karışımının değiştirilmiş bir versiyonunu veya tek çinko kaynağı olarak kalprotektin kullanımını kullanın.
   1. Pozitif kontrollü bir ön karışım için, transferrin ön karışımına 50 μM ZnSO₄ ekleyin. Negatif kontrol için 50 μM TPEN ekleyin ve çinkoyu çıkarın. Ardından, ihtiyaç duyulan her numune kuyusu için bunların her birinden 10 μL alın ve bu hacmi yeni bir tüpe taşıyın. Buna yarısı kadar steril PBS ekleyin. Örneğin, 10 kuyu pozitif kontrol ön karışımını alacaksa, 100 μL ön karışım alın, yeni bir tüpe taşıyın ve 50 μL PBS ekleyin. Negatif kontrol için de aynısını yapın.
   2. S100A7 veya kalprotektin ön karışımını yapmak için, gereken kuyu başına 10 μL negatif kontrol ön karışımı alın, yeni bir tüpe taşıyın ve bu hacmin yarısını %25 Zn-S100A7 veya kalprotektin ekleyin. Büyüme testinde 15 μL ön karışım kullanın ve 85 μL kültürle seyreltin. Transferrinler için nihai konsantrasyonlar, ilave 5 μM Zn, TPEN veya S100A7/kalprotektin ile adım 8.5'tektin ile aynı kalır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
125 mL tabanca şişeleri	Çan	2578-S0030	Özel sipariş edilmelidir
2-Merkaptoetanol	VWR	M131 Serisi	Çeker ocakta açık
3MM Kağıt	GE Sağlık	3030-6461	Metinde "filtre kağıdı" olarak adlandırılır
Agaroz	Biolone	BIO-41025	Toz
Amonyum klorür	Sigma-Aldrich	A9434 Serisi	Toz
Sığır transferrini	Sigma-Aldrich	T1428 Serisi	Toz
Kalsiyum klorür dihidrat	Sigma-Aldrich	C5080 Serisi	Toz
Kalsiyum pantotenat	Sigma-Aldrich	C8731 (İngilizce)	Toz
Kalprotektin	YOK	YOK	Bunu bir işbirlikçi tarafından sağlıyoruz
Chelex-100 Reçine	Biyo-Rad	142-2832	Kullanmadan önce deiyonize su ile yıkayınız
Pamuk uçlu steril çubuk	Püriten	25-806	Bu uygulama için pamuk polyesterden daha iyidir
Deferoksamin	Sigma-Aldrich	D9533 Serisi	Toz
D-glikoz	Sigma-Aldrich	G8270 Serisi	Toz
Diyaliz kaseti	Termo	66380	Kullanmadan önce tamponda önceden ıslatın
Etanol	Koptek	V1016 Serisi	Yanıcı sıvı, yanıcı dolapta saklayın
Demir klorür	Sigma-Aldrich	F7134 Serisi	Tahriş edici, solumayın
Ferrik nitrat nonahidrat	Sigma-Aldrich	F1143 Serisi	Tahriş edici, solumayın
GC orta taban	Difco	228950	Toz, zaten agar içeriyor
Glisin	Sigma-Aldrich	G8898 Serisi	Toz
HEPES	Balıkçı	L-15694	Toz
İnsan transferrin	Sigma-Aldrich	T2030 Serisi	Toz
Hipoksantin	Sigma-Aldrich	H9377 Serisi	Toz
Klett kolorimetre	Manostat	37012-0000	Kültür yoğunluğunu değerlendirmek için renk iletimini kullanır
L-alanin	Sigma-Aldrich	A7627 Serisi	Toz
L-arginin	Sigma-Aldrich	A5006 Serisi	Toz
L-asparagin monohidrat	Sigma-Aldrich	A8381 Serisi	Toz
L-aspartat	Sigma-Aldrich	A9256 Serisi	Toz
L-sistein hidroklorür	Sigma-Aldrich	C1276 (İngilizce)	Toz
L-sistin	Sigma-Aldrich	C8755 (İngilizce)	Toz
L-glutamat	Sigma-Aldrich	G1251 Serisi	Toz
L-glutamin	Sigma-Aldrich	G3126 Serisi	Toz
L-histidin monohidroklorür	Sigma-Aldrich	H8125 Serisi	Toz
L-izolösin	Sigma-Aldrich	I2752	Toz
L-lösin	Sigma-Aldrich	L8000 Serisi	Toz
L-lizin	Sigma-Aldrich	L5501 Serisi	Toz
L-metiyonin	Sigma-Aldrich	M9625 Serisi	Toz
L-fenilalanin	Sigma-Aldrich	P2126	Toz
L-prolin	Sigma-Aldrich	P0380	Toz
L-serin	Sigma-Aldrich	S4500 Serisi	Toz
L-treonin	Sigma-Aldrich	T8625 Serisi	Toz
L-triptofan	Sigma-Aldrich	T0254 Serisi	Toz
L-tirozin	Sigma-Aldrich	T3754 Serisi	Toz
L-valin	Sigma-Aldrich	V0500 Serisi	Toz
Magnezyum sülfat	Sigma-Aldrich	M7506 Serisi	Toz
Metanol	VWR	BDH1135-4LP	Yanıcı sıvı, yanıcı dolapta saklayın
Potasyum fosfat dibazik	Sigma-Aldrich	60356	Toz
Potasyum fosfat monobazik	Sigma-Aldrich	P9791	Toz
Potasyum sülfat	Sigma-Aldrich	P0772	Toz
Patates nişastası	Sigma-Aldrich	S4251	Toz
Azaltılmış glutatyon	Sigma-Aldrich	G4251 Serisi	Dikkatli tutun. Kolayca oksitlenebilir.
S100A7 Serisi	YOK	YOK	Bunu bir işbirlikçi tarafından sağlıyoruz
Sodyum bikarbonat	Sigma-Aldrich	S5761	Toz
Sodyum klorür	VWR	470302	Toz
Sodyum sitrat	Balıkçı	S279	Toz
Sodyum hidroksit	Acros Organik	383040010	Son derece higroskopik
Tiamin hidroklorür	Sigma-Aldrich	T4625 Serisi	Toz
Tiamin pirofosfat	Sigma-Aldrich	C8754	Kokarboksilaz olarak da adlandırılır
TPEN	Sigma-Aldrich	P4413	Toz
Tris	VWR	497	Toz
Urasil	Sigma-Aldrich	U0750 Serisi	Toz
Çinko sülf heptahidrat	Sigma-Aldrich	204986	Tahriş edici, solumayın