Metale Duyarlı Genlerin Rolünü İncelemek için Metal Sınırlı Bakteri Büyüme Testi

Özet

Kaynak: Maurakis, S., ve diğerleri. Metale Duyarlı Genlerin Karakterizasyonu ve Konakçı Ligandlardan Metal Edinimi için Neisseria gonorrhoeae'nin Metal Sınırlı Büyümesi. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, metale duyarlı genlerin rolünü incelemek için metal sınırlı bir bakteri büyüme testini göstermektedir. Metalden yoksun ortamda yetiştirilen vahşi tip ve mutant bakteriler, metal ligandı ile inkübe edilir ve büyümeleri bir plaka okuyucu kullanılarak izlenir. Metalin tükendiği koşullar altında, vahşi tip bakteriler, metal alımını ve büyümesini sağlayan bir yüzey reseptörü eksprese ederken, mutant bu reseptörden yoksundur ve bu da sınırlı büyümeye neden olur.

Protokol

1. Chelex ile İşlenmiş Tanımlanmış Ortam (CDM) Stok Çözeltilerinin Hazırlanması

1. Stok çözümü I
   1. Sodyum klorür veya NaCl (233.8 g), potasyum sülfat veya K₂SO₄ (40.0 g), amonyum klorür veya NH₄Cl (8.8 g), dipotasyum hidrojen fosfat veya K₂HPO₄ (13.9 g) ve monopotasyum dihidrojen fosfat veya KH₂PO₄ (10.9 g) deiyonize suda 1 L'lik bir nihai hacme kadar birleştirin.
   2. Çözeltiyi ve alikot'u 50 mL'lik konik tüplere filtreyle sterilize edin.
   3. -20 °C'de saklayın.
2. Stok çözümü II
   1. Tiamin hi....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
125 mL tabanca şişeleri	Çan	2578-S0030	Özel sipariş edilmelidir
2-Merkaptoetanol	VWR	M131 Serisi	Çeker ocakta açık
3MM Kağıt	GE Sağlık	3030-6461	Metinde "filtre kağıdı" olarak adlandırılır
Agaroz	Biolone	BIO-41025	Toz
Amonyum klorür	Sigma-Aldrich	A9434 Serisi	Toz
Sığır transferrini	Sigma-Aldrich	T1428 Serisi	Toz
Kalsiyum klorür dihidrat	Sigma-Aldrich	C5080 Serisi	Toz
Kalsiyum pantotenat	Sigma-Aldrich	C8731 (İngilizce)	Toz
Kalprotektin	YOK	YOK	Bunu bir işbirlikçi tarafından sağlıyoruz
Chelex-100 Reçine	Biyo-Rad	142-2832	Kullanmadan önce deiyonize su ile yıkayınız
Pamuk uçlu steril çubuk	Püriten	25-806	Bu uygulama için pamuk polyesterden daha iyidir
Deferoksamin	Sigma-Aldrich	D9533 Serisi	Toz
D-glikoz	Sigma-Aldrich	G8270 Serisi	Toz
Diyaliz kaseti	Termo	66380	Kullanmadan önce tamponda önceden ıslatın
Etanol	Koptek	V1016 Serisi	Yanıcı sıvı, yanıcı dolapta saklayın
Demir klorür	Sigma-Aldrich	F7134 Serisi	Tahriş edici, solumayın
Ferrik nitrat nonahidrat	Sigma-Aldrich	F1143 Serisi	Tahriş edici, solumayın
GC orta taban	Difco	228950	Toz, zaten agar içeriyor
Glisin	Sigma-Aldrich	G8898 Serisi	Toz
HEPES	Balıkçı	L-15694	Toz
İnsan transferrin	Sigma-Aldrich	T2030 Serisi	Toz
Hipoksantin	Sigma-Aldrich	H9377 Serisi	Toz
Klett kolorimetre	Manostat	37012-0000	Kültür yoğunluğunu değerlendirmek için renk iletimini kullanır
L-alanin	Sigma-Aldrich	A7627 Serisi	Toz
L-arginin	Sigma-Aldrich	A5006 Serisi	Toz
L-asparagin monohidrat	Sigma-Aldrich	A8381 Serisi	Toz
L-aspartat	Sigma-Aldrich	A9256 Serisi	Toz
L-sistein hidroklorür	Sigma-Aldrich	C1276 (İngilizce)	Toz
L-sistin	Sigma-Aldrich	C8755 (İngilizce)	Toz
L-glutamat	Sigma-Aldrich	G1251 Serisi	Toz
L-glutamin	Sigma-Aldrich	G3126 Serisi	Toz
L-histidin monohidroklorür	Sigma-Aldrich	H8125 Serisi	Toz
L-izolösin	Sigma-Aldrich	I2752	Toz
L-lösin	Sigma-Aldrich	L8000 Serisi	Toz
L-lizin	Sigma-Aldrich	L5501 Serisi	Toz
L-metiyonin	Sigma-Aldrich	M9625 Serisi	Toz
L-fenilalanin	Sigma-Aldrich	P2126	Toz
L-prolin	Sigma-Aldrich	P0380	Toz
L-serin	Sigma-Aldrich	S4500 Serisi	Toz
L-treonin	Sigma-Aldrich	T8625 Serisi	Toz
L-triptofan	Sigma-Aldrich	T0254 Serisi	Toz
L-tirozin	Sigma-Aldrich	T3754 Serisi	Toz
L-valin	Sigma-Aldrich	V0500 Serisi	Toz
Magnezyum sülfat	Sigma-Aldrich	M7506 Serisi	Toz
Metanol	VWR	BDH1135-4LP	Yanıcı sıvı, yanıcı dolapta saklayın
Potasyum fosfat dibazik	Sigma-Aldrich	60356	Toz
Potasyum fosfat monobazik	Sigma-Aldrich	P9791	Toz
Potasyum sülfat	Sigma-Aldrich	P0772	Toz
Patates nişastası	Sigma-Aldrich	S4251	Toz
Azaltılmış glutatyon	Sigma-Aldrich	G4251 Serisi	Dikkatli tutun. Kolayca oksitlenebilir.
S100A7 Serisi	YOK	YOK	Bunu bir işbirlikçi tarafından sağlıyoruz
Sodyum bikarbonat	Sigma-Aldrich	S5761	Toz
Sodyum klorür	VWR	470302	Toz
Sodyum sitrat	Balıkçı	S279	Toz
Sodyum hidroksit	Acros Organik	383040010	Son derece higroskopik
Tiamin hidroklorür	Sigma-Aldrich	T4625 Serisi	Toz
Tiamin pirofosfat	Sigma-Aldrich	C8754	Kokarboksilaz olarak da adlandırılır
TPEN	Sigma-Aldrich	P4413	Toz
Tris	VWR	497	Toz
Urasil	Sigma-Aldrich	U0750 Serisi	Toz
Çinko sülf heptahidrat	Sigma-Aldrich	204986	Tahriş edici, solumayın