Neisseria gonorrhoeae'deki Yüzey Metal Taşıyıcılarının Nokta Blot Kullanılarak Tespiti

Özet

Kaynak: Maurakis, S. ve Cornelissen, C. N. Metale Duyarlı Genlerin Karakterizasyonu ve Konakçı Ligandlardan Metal Edinimi için Neisseria gonorrhoeae'nin Metalle Sınırlı Büyümesi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, ligand bağlanması, antikor tespiti ve kolorimetrik görselleştirmeyi içeren bir nokta leke tahlili kullanılarak metal sınırlı koşullar altında yetiştirilen Neisseria gonorrhoeae'de yüzey metal taşıyıcılarını tespit etme prosedürünü göstermektedir.

Protokol

1. Dış Membran Metal Taşıyıcıları Tarafından Ligand Bağlanmasının Tespiti

1. Kültürleri üç hacim CDM (chelex ile muamele edilmiş tanımlanmış ortam) ile seyreltin.
2. Daha sonra 4 saat çalkalayarak inkübe edin.
3. 4 saat işaretinden kısa bir süre önce, üç parça filtre kağıdı ve bir parça nitroselülozu, bir nokta leke aparatına sığması için gereken yaklaşık boyutta kesin. Nitroselülozu deiyonize suya önceden batırın, ardından aparatı nitroselülozun altına filtre kağıdı ile monte edin.
4. 4 saatte hücre yoğunluklarını kaydedin ve uygun bir nihai yoğunluğa standartlaştırın.
5. Hücre kültürlerini nitroselüloz üzerine pipetleyin ve filtre kağıdının tüm sıvıyı emmesi için yeterli zaman tanıyın.
6. Aparatı sökün, lekenin kurumasını bekleyin ve nitroselüloz membranı Tris tamponlu salin içinde% 5 sığır serum albümini veya yağsız süt (a/h) içinde 1 saat bloke edin.
7. Nitroselülozun altında sızdırmaz bir conta oluşturmak için filtre kağıdını parafin filmle değiştirerek nokta leke aparatını yeniden monte edin.
8. İlgilenilen metal bağlayıcı ligandı bloker ve prob hücrelerinde 1 saat boyunca 0,2 μM'ye seyreltin.
9. Sıvıyı vakumla sifonlayın, lekeyi yıkayın, ardından sinyali geliştirmek için standart immünolojik prosedürleri izleyin. Yıkama adımları aparatın içinde veya dışında yapılabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
125 mL tabanca şişeleri	Çan	2578-S0030	Özel sipariş edilmelidir
2-Merkaptoetanol	VWR	M131 Serisi	Çeker ocakta açık
3MM Kağıt	GE Sağlık	3030-6461	Metinde "filtre kağıdı" olarak adlandırılır
Kurutma derecesi engelleyici	Biyo-Rad	170-6404	Yağsız kuru süt
Sığır serum albümini	Roche	3116964001	Toz
Kalprotektin	YOK	YOK	Bunu bir işbirlikçi tarafından sağlıyoruz
Chelex-100 Reçine	Biyo-Rad	142-2832	Kullanmadan önce deiyonize su ile yıkayınız
Pamuk uçlu steril çubuk	Püriten	25-806	Bu uygulama için pamuk polyesterden daha iyidir
Nokta leke aparatı	Schleicher & Schwell	10484138	Numune yüklemeden önce kapağı mümkün olduğunca sıkı bir şekilde kilitleyin
Etanol	Koptek	V1016 Serisi	Yanıcı sıvı, yanıcı dolapta saklayın
Klett kolorimetre	Manostat	37012-0000	Kültür yoğunluğunu değerlendirmek için renk iletimini kullanır
Metanol	VWR	BDH1135-4LP	Yanıcı sıvı, yanıcı dolapta saklayın
Nitroselüloz	GE Sağlık	10600002	Kullanana kadar koruyucu kılıf içinde saklayın
S100A7 Serisi	YOK	YOK	Bunu bir işbirlikçi tarafından sağlıyoruz
Sodyum klorür	VWR	470302	Toz
Tris	VWR	497	Toz