Mycobacterium smegmatis Yanlış Çeviri Oranlarının GFP/Lusiferaz Raportör Sistemi Kullanılarak Ölçülmesi

Özet

Kaynak: Chen, Y., ve diğerleri, Fonksiyon Kazanımı Raportör Sistemleri ile Spesifik Mikobakteriyel Yanlış Çeviri Oranlarının Ölçümü. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, indüklenebilir bir GFP ve salgılanan mutant lusiferaz raportör sistemi kullanarak Mycobacterium smegmatis'teki yanlış çeviriyi ölçmek için bir yöntem göstermektedir. Yanlış çeviriden kaynaklanan lüminesansın nasıl ölçüldüğünü ve bir test molekülünün çeviri doğruluğu üzerindeki etkisini değerlendirmek için GFP floresansı ile nasıl karşılaştırıldığını gösterir.

Protokol

1. Nanoluc lusiferaz (Nluc)/Yeşil floresan protein (GFP) Raportör

NOT: Bu yöntemin görsel bir temsili için Şekil 1'e bakın.

1. Bakteri raportör suşunu -80 °C stoktan 2 mL 7H9 ortamı ile aşılayın. OD₆₀₀ sabit faza (OD >3) ulaşana kadar 1 ila 2 gün boyunca 37 °C'de çalkalayın.
2. 50 mL 7H9 ortamına alt kültür yapın ve OD₆₀₀ geç durağan faza (>4) ulaşana kadar büyütün.
3. Bakterileri 96 oyuklu bir plakaya ayırmadan önce, 50 ng/mL'lik bir nihai konsantrasyonda anhidrotetrasiklin (ATC) ekleyin ve iyice karıştırın. Yığın kültürünün indüksiyonu, tüm kuyucukların aynı miktarda indükleyici içermesini ve raportörün indüksiyonunun senkronize olmasını sağlar. Bakterileri, her bir oyukta 100 μL hacim bulunan berrak, yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya ayırın.
4. Yanlış çeviri oranlarını etkileyen küçük molekülleri taramak için, kuyucukları seçmek için bileşiği belirtilen konsantrasyonda ekleyin. Bu protokolün amaçları doğrultusunda, örnek olarak kasugamisin ( Şekil 2'de belirtilen dozlarda) kullanın. Kuyucukları seçmek için farklı dozlarda kasugamisin ekleyin (her deney grubu en az iki biyolojik kopya içermelidir).
5. Numuneleri çalkalayın ve 37 °C'de 16-20 saat indükleyin.
   NOT: Plakayı filmle kapatmak gerekir. Ayrıca, test kuyularından buharlaşmayı sınırlamak için tüm kenar kuyularının en az 200 μL steril su ile doldurulması gerekir.
6. Çok kanallı bir pipet kullanarak her kuyucuktan 80 μL alın ve numuneleri siyah 96 oyuklu bir plakaya aktarın (bu, floresan sinyal ölçümünü en üst düzeye çıkarır). GFP sinyalini entegrasyon süresi olarak 20 ms ile luminometre ile ölçün.
7. GFP sinyalini ölçtükten sonra, plakayı 10 dakika boyunca 3.220 x g'da santrifüjleyin. 50 μL süpernatantı beyaz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın (lüminesans sinyali ölçümünü en üst düzeye çıkarır), her bir oyuğa 50 μL Nluc substratı ekleyin, iyice karıştırın ve lüminesansı entegrasyon süresi olarak 1.000 ms ile luminometre ile ölçün.
8. Düzeltilmiş Nluc lüminesans değerlerini GFP floresansına bölerek Nluc/GFP oranını belirleyin: bu ölçü (isteğe bağlı birimlerde), asparajin yanlış çevirisi için aspartatın nispi bir ölçüsüdür.

Sonuçlar

Şekil 1: Yanlış çeviri oranının ölçülmesinin ana hatları Nluc-GFP muhabiri. Nluc ve GFP muhabirleri ile dönüştürülen taze bir M. smegmatis kültürü, test edilecek tüm plakalar için yeterli bir hacme kadar büyütülür (~10 mL/96 oyuklu plaka...

Malzemeler