Tiplendirilemeyen Haemophilus influenzae ile Enfekte Bir Fare Modelinden Bronkoalveoler Lavaj Sıvısı Toplanması

Özet

Kaynak: Venuprasad, K., ve diğerleri. Hava Yolu Enflamasyonunu İncelemek İçin Fare Modellerinde Haemophilus influenzae'nin Trakeal İçi Uygulaması. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, aşağı akış analizi için tiplendirilemeyen Haemophilus influenzae ile enfekte ötenazi uygulanmış bir fareden bronkoalveoler lavaj sıvısının toplanmasını ve işlenmesini göstermektedir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Bronkoalveoler Lavaj Sıvısı (BALF) Koleksiyonu
   1. Enfeksiyondan 24 saat sonra fareyi servikal çıkık ile kurban edin.
   2. Farenin karın boşluğunu anatomik makasla açın, ventral aortu kanamak için kesin ve akciğerin ventral kısmını ortaya çıkarın.
   3. Trakeayı açığa çıkarın ve 20 gauge kateterle entübe edin. 0.8 ml BALF tamponu (1x PBS (Fosfat tamponlu salin)% 0.1 dekstroz, 10 U / ml heparin) damlatın ve lavajı nazik aspirasyon ile toplayın. Bu prosedürü üç kez tekrarlayın.
   4. Tripan Mavisi boyama ile 10X büyütme altında bir hemositometre kullanarak 100 ul BALF süspansiyonundaki toplam hücre sayısını sayın.
   5. Modifiye Giemsa boyama için slaytlar hazırlayın. 100 ul BALF'yi sitospinin uygun kuyucuklarına ayırın ve 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Slaytları 10 dakika kurutun ve üreticinin protokollerine göre modifiye edilmiş Giemsa boyası kullanarak hücreleri boyayın.
   6. Kalan hücreler, floresanla aktive olan hücre sınıflandırması (FACS), konfokal mikroskopi, gen ekspresyonu ve western blot gibi sonraki analizler için kullanılabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dekstroz Susuz	Themo Bilimsel	R01300 Serisi
Heparin	Hospira, Inc	RL-3010
Şırınga iğnesi 20/26G	BD	(REF305115/175)
1 ml şırınga	BD	REFERANS 309602
Kateter 20GA	BD	REFERANS 381433
Cımbız #5 Paslanmaz çelik, 11 cm uzunluğunda	Kentbilimsel	INS600095
5ml Polistiren yuvarlak tabanlı tüpler	BD	REFERANS 352058
1,5 ml Mikrosantrifüj tüpleri	Işık Laboratuvarları	A-7001-R
1X PBS (Fosfat tamponlu salin)	Gibco	10010-023
RBC Lizis Tamponu (10X)	Biyolojik Efsane	420301